木霉细胞外囊泡递送milRNA抑制灰霉病，田间防效78.71%接近腐霉利

世界农化网中文网报道：近日，海南大学热带农林学院刘铜教授团队在《Plant Physiology》发表题为《A Trichoderma milRNA cross-species targeting chitin synthases genes is delivered by carbon nanomaterials to suppress Botrytis cinerea》的研究，首次揭示生防木霉通过细胞外囊泡向灰霉病菌″投递″milRNA、精准切割其几丁质合成酶基因的跨物种RNAi机制，并利用椰子水碳点纳米载体实现田间防效78.71%，接近化学杀菌剂腐霉利（82.84%）。

图 1 ｜ 木霉T069细胞外囊泡（EVs）的分离鉴定及Tri-milR29的跨域递送证据

研究首次证实木霉milRNA经细胞外囊泡跨物种″沉默″病原菌，锁定精准切割位点。团队从短梗木霉（Trichoderma breve）T069培养液中分离细胞外囊泡，透射电镜、PKH26染色、纳米颗粒示踪及Evp1标记蛋白共定位等多重证据证实其纯度与特异性；酶保护实验显示完整囊泡内的Tri-milR29可抵抗MNase和蛋白酶K降解，破膜后迅速降解，PKH26标记囊泡与灰霉病菌共孵育后菌丝内检出荧光，Northern blot在共培养体系中稳定检出Tri-milR29。突变体分析表明，过表达Tri-milR29使木霉对灰霉病菌的平板抑制率较野生型提高17.7%和9.2%，沉默株则下降；扫描电镜可见病原菌菌丝缠绕、穿孔。

通过靶标验证显示，Tri-milR29同时靶向灰霉病菌的BcCHS7与BcCHS6，5′ RLM-RACE分别以12个和18个独立克隆确认切割位点位于第1172/1173位和第2912/2913位碱基；而由生防菌天然产生、并靶向病原菌几丁质合成酶基因的sRNA，此前尚未见报道。双靶点带来了明显的协同效应，敲除靶基因或过表达Tri-milR29均导致菌丝扭曲、细胞壁不完整、致病力显著下降。更值得注意的是，与植物miRNA通常在5′端第10-11位碱基处切割靶标不同，Tri-milR29对BcCHS7、BcCHS6的切割位点分别位于第17-18位和第6-7位碱基，属非常规切割位点，提示跨物种miRNA调控机制比既有认知更为复杂。