基于大肠杆菌的MS2病毒样颗粒助力RNAi防控草地贪夜蛾

世界农化网中文网报道： 近日，中国农业科学院深圳农业基因组研究所张江课题组在 New Plant Protection期刊发表题为″MS2 virus-like particles enhances artificial microRNA-induced RNA interference in the fall armyworm, Spodoptera frugiperda″的简报文章。该研究建立了一套基于大肠杆菌的MS2病毒样颗粒（virus-like particles，VLPs）与人工microRNA（artificial microRNA，amiRNA）共表达体系，并证明了MS2 VLPs能够显著增强amiRNA在草地贪夜蛾中的口服RNAi效果，为鳞翅目害虫RNAi生物农药的筛选与开发提供了新的技术工具。

研究背景

草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda）是全球重要的农业害虫之一。随着其对多种化学农药及苏云金芽孢杆菌毒素抗性的不断演化，开发更加绿色、高效且具有靶标特异性的新型防控技术已成为植物保护领域的重要课题。

RNA干扰（RNA interference，RNAi）因环境友好、靶标特异性高、对非靶标生物相对安全等优势，被认为是极具潜力的下一代害虫防控策略。然而，对于草地贪夜蛾等鳞翅目害虫，RNA分子在消化道中易被快速降解等因素显著限制了RNAi效率。因此，如何保护RNAi触发分子并提高其口服递送效率，仍是RNA农药开发面临的重要技术瓶颈。

研究内容

1、MS2病毒样颗粒，能否破解鳞翅目害虫RNAi效率难题？

RNAi技术应用于害虫防控的一个核心前提是，RNA分子能够在进入昆虫体内后能保持足够的稳定性，并有效触发靶基因沉默。

然而，对于许多鳞翅目昆虫而言，这并不容易实现。研究表明，RNA分子进入昆虫消化道后容易受到降解，导致有效RNAi触发分子的数量下降。此前的研究发现，MS2噬菌体来源的VLPs能够提高人工miRNA的稳定性和生物活性，并在棉铃虫（Helicoverpa armigera）和斜纹夜蛾（Spodoptera litura）中表现出RNAi递送潜力。不过，MS2 VLPs能否用于增强草地贪夜蛾中的RNAi效应，此前尚未得到验证。

针对这一问题，研究团队聚焦于草地贪夜蛾的几丁质合酶2基因（Chitin synthase 2，CHS2）。CHS2主要在昆虫的中肠表达，参与几丁质合成以及围食膜（peritrophic matrix，PM）的形成，对鳞翅目昆虫正常生长发育具有重要作用。因此，研究人员以SfCHS2为靶标，设计了人工miRNA（amiRCHS2），用于检验MS2VLPs能否增强其RNAi活性。

2、一套细菌共表达系统，同时生产″载体″和″RNA武器″

为了实现MS2 VLPs与amiRNA的高效生产，研究人员在Escherichia coli BL21 (DE3) RNase III-系统中，同时表达MS2衣壳蛋白和amiRCHS2。

SDS-PAGE结果显示，工程菌中成功表达了约28 kDa的MS2衣壳蛋白；Northern blot则检测到约138 nt的amiRCHS2转录本。这表明，该大肠杆菌表达体系能够同时生产目标amiRNA和MS2 VLPs。换言之，研究团队构建了一个可以在细菌中同步生产″RNAi效应分子″与″递送保护载体″的平台，为后续功能评价奠定了基础。

3、VLPs″护航″后，靶基因沉默效果显著增强

那么，MS2 VLPs能否真正提高草地贪夜蛾中的RNAi效率？

研究人员将不同工程菌掺入人工饲料，饲喂初孵草地贪夜蛾幼虫，并比较不同处理组幼虫的SfCHS2基因表达量、幼虫体重和虫体大小。结果显示，在处理后第5天，与仅摄食表达amiRCHS2工程菌的幼虫相比，摄食同时表达MS2 VLPs和amiRCHS2（VLP- amiRCHS2）工程菌的幼虫，其SfCHS2表达水平显著降低（图1）。

值得注意的是，仅表达amiRCHS2时，其SfCHS2表达水平与MS2 VLP单独处理组以及空载体对照组之间均没有显著差异。也就是说，在这一实验体系中，单独的amiRCHS2不足以产生显著的RNAi效果，而MS2 VLPs的加入显著放大了这一效应。

图1 大肠杆菌中共同表达MS2 VLPs和amiRCHS2显著提高草地贪夜蛾RNAi效率

4、不只针对CHS2：另一靶基因同样实现RNAi增效

为了进一步验证该策略的通用性，研究团队还设计了针对草地贪夜蛾Amylase2基因的amiRNA。Amylase2编码重要的昆虫消化酶，与昆虫存活和发育密切相关。实验结果同样表明，当幼虫摄入共表达MS2 VLPs和靶向Amylase2的amiRNA 的工程菌后，也可以观察到增强的RNAi响应（图2）。这一结果说明，MS2 VLPs的增效作用并非局限于单一靶基因，而是具有进一步拓展至不同RNAi靶标的潜力。

图2 大肠杆菌中共同表达MS2 VLPs和amiRAmylase2显著提高草地贪夜蛾RNAi效率

5、从″RNA容易降解″到″VLP保护递送″，为RNA农药研发打开新思路

本研究建立了一种能够在大肠杆菌中同步生产MS2 VLPs和靶标特异性amiRNA的共表达体系，并在草地贪夜蛾中验证了该体系对RNAi的增效作用。

研究证明，MS2 VLPs能够显著增强针对至少两个草地贪夜蛾基因的口服amiRNA效果，并进一步引发生长发育相关表型变化。作者认为，将可规模化的细菌生产体系与VLP递送载体相结合，有望构建一个用于高通量筛选和开发RNAi生物农药的平台，尤其适用于对RNAi响应较弱的鳞翅目害虫。

研究意义

对于RNA农药而言，″找到有效靶标″只是第一步，如何让RNA稳定、有效地到达作用位置同样关键。本研究通过MS2 VLPs为amiRNA″保驾护航″，进一步拓展了RNAi技术在草地贪夜蛾绿色防控中的应用前景，也为破解鳞翅目害虫RNAi效率偏低这一长期难题提供了新的研究路径。

文章链接：https://doi.org/10.1002/npp2.70047