华南农大与广东农科院水稻所开发高效基因编辑工具箱, 实现水稻多重编辑与农艺性状定向改良

世界农化网中文网报道：近日, 华南农业大学祝钦泷、谢先荣教授团队联合广东省农业科学院水稻研究所谭健韬副研究员团队在JIPB在线发表了题为"Engineering AP/Exo-Cas12 as an efficient toolbox for rice genome editing via integrated repair and exonuclease modules"的研究论文。该研究将选择富集、AP修复通路调控和5′核酸外切酶融合等策略进行模块化整合, 开发出适用于Cas12iMax、Cas12j-19和xCas12iMax的AP/Exo-Cas12水稻基因编辑工具箱, 实现了高效多重编辑、较大多碱基缺失及农艺性状定向改造, 为紧凑型Cas12的植物应用提供了新的优化框架。

归属于Ⅱ类Ⅴ型CRISPR系统的Cas12iMax、Cas12j-19和xCas12iMax, 具有蛋白结构紧凑、PAM识别类型多样、可产生交错DNA双链断裂及较大插入/缺失突变等特点, 能够拓展传统Cas9受NGG PAM限制的靶向范围, 在富含AT的编码区和调控区编辑中具有重要应用潜力。然而, 这些紧凑型Cas12效应器在植物中的活性往往受到效应器类型、靶序列及表达环境的显著影响, 编辑效率不稳定, 制约了其在多基因编辑和作物遗传改良中的进一步应用。因此, 开发可根据不同Cas12效应器和靶点灵活适配的优化策略具有重要意义。

研究团队首先构建了水稻密码子优化的Cas12iMax、Cas12j-19和xCas12iMax编辑器, 并比较了三种crRNA表达架构。结果表明, 多个Pol Ⅲ启动子分别驱动crRNA的构型可在部分靶点获得较高的xCas12iMax基础活性 (图1A, B)。为进一步富集高水平表达Cas12的转化细胞, 研究团队通过2A肽将Cas12与潮霉素抗性蛋白HPT偶联, 使xCas12iMax在两个代表性靶点的平均编辑效率分别由17.95%和37.43%提高至21.85%和61.74%。研究还发现, xCas12iMax在水稻中对WTT及特定WTN PAM表现出较强偏好, 为该工具的靶点选择与应用提供了重要参考 (图1C)。

针对部分Cas12效应器活性较低的问题, 该研究进一步建立了两条互补的优化路线。AP-Cas12模块通过融合胞嘧啶脱氨酶evoFERNY和尿嘧啶DNA糖基化酶UDG, 招募碱基切除修复通路并诱导额外DNA损伤, 使部分原本未检测到有效编辑的Cas12iMax和Cas12j-19靶点获得编辑活性。其中, AP-Cas12iMax-HPT产生的编辑产物中, 超过45 bp的缺失占55.4%, 有利于实现基因及非编码调控元件的有效功能破坏 (图1D, E, G)。

与此同时, 研究团队分别将T5E、PapE和IME三种5′核酸外切酶与xCas12iMax融合, 促进Cas12切割后的DNA断端切除。结果表明, 不同外切酶与Cas12的适配效果存在明显差异, 其中PapE-xCas12iMax-HPT表现最佳, 在代表性靶点的平均编辑效率达到86.81%, 高于T5E-xCas12iMax-HPT的70.97%和IME-xCas12iMax-HPT的33.32%。此外, PapE-xCas12iMax-HPT产生的突变以21–45 bp缺失为主, 占全部插入/缺失事件的71.1%, 显示出较强的多碱基缺失能力 (图1F, G)。

为评价该工具的多重编辑性能, 研究团队利用单个PapE-xCas12iMax-HPT载体同时靶向4个水稻内源位点。结果显示, 4个位点均获得有效编辑, 单个位点平均编辑效率为15.24%–52.00%, 总体平均效率达到30.7%; 其中33个独立愈伤组织同时携带4个位点突变, 四位点同步编辑率达到34.4% (33/96), 展现出良好的多重编辑能力和可扩展性 (图1H)。

在转基因T₀植株中, PapE-xCas12iMax-HPT在Gn1a和DEP1位点的双等位编辑率分别达到92.3% (24/26) 和100% (26/26), 其中24株植株同时获得两个基因的双等位突变。该系统产生的20–50 bp缺失还能够在常规PCR和凝胶电泳中形成明显的条带差异, 为双等位编辑材料的快速、低成本初筛提供了便利 (图1I)。

在应用验证方面, 研究团队利用优化后的AP/Exo-Cas12系统对Gn1a、DEP1和GS3等重要农艺性状基因进行编辑。获得的gn1a dep1双突变体表现出株高和穗长降低、穗型紧凑以及每穗粒数增加等特征; AP-Cas12iMax介导的GS3敲除则显著增加了水稻籽粒长度, 完成了从编辑工具优化到农艺性状创制的系统验证 (图1K, L, M)。

图1 AP/Exo-Cas12工具箱的开发及其在水稻多重编辑和农艺性状改良中的应用

值得一提的是, 团队此前已开发出高效的Exo-Cas12i2 v1水稻多基因编辑系统 (Chai et al., 2026), 其最高编辑效率达到84.2%, 并成功实现水稻内源MITE元件的定点大片段删除及相关性状调控。在此基础上, 本研究进一步将外切酶融合、AP修复和选择富集纳入统一的模块化框架, 并拓展至多种紧凑型Cas12效应器, 持续拓宽Cas12在植物基因组编辑中的适用范围和优化路径。

综上, 该研究开发的AP/Exo-Cas12并非单一的高效核酸酶, 而是一套能够根据Cas12种类、靶位点特征和预期编辑产物进行灵活组合的"靶点适配型"工具箱。该系统兼具活性增强、多位点编辑、较大多碱基缺失和突变体快速筛选等优势, 可有效补充Cas9的靶向空间, 为植物编码区和非编码调控元件研究、复杂性状聚合及作物精准育种提供重要工具和策略。

论文链接：https://doi.org/10.1111/jipb.70440