南方水稻黑条矮缩病防控药剂的创制与应用

世界农化网中文网报道： 南方水稻黑条矮缩病潜隐性强、危害重、防控难度大，是中国、越南等国家稻区水稻重要病害之一，可危害水稻、玉米等禾本科作物的安全生产。该病害的病原为南方水稻黑条矮缩病毒(Southern rice black-streaked dwarf virus， SRBSDV)，是由媒介昆虫——白背飞虱 Sogatella furcifera(white-backed planthopper，WBPH)传播所致。

1、药剂创制思路


南方水稻黑条矮缩病存在潜隐性强、危害重、缺乏安全高效的防控药剂、防控难度大等特点。2005年，宋宝安教授团队基于水稻媒介昆虫传播病毒的流行规律，针对“病毒、植物寄主、媒介昆虫”三要素，构建“三位一体”靶标模型，并从天然产物中寻找高活性、新结构的先导化合物，基于手性分子原理进行结构衍生和修饰，通过高活性和低风险2个指标进行新药剂创制。经多年的攻关研究，创制出系列植物免疫激活剂、病毒增殖抑制剂、媒介昆虫传毒阻断剂(陈卓和宋宝安，2011)(图1)。

2、高活性药剂的发现与应用

2.1 免疫激活剂的发现

本团队建立 SRBSDV 介导水稻悬浮细胞的药剂筛选模型和活体水稻筛选模型，并建立基于系统性获得性抗性(systemic acquired resistance，SAR)通路关键蛋白的生化和分子生物学方法，用于免疫激活剂筛选。例如，采用介导法将SRBSDV转入水稻悬浮细胞，经毒氟磷处理后病毒含量显著降低。

以S7-1基因作为病毒抑制指标，发现毒氟磷在细胞水平上对病毒的抑制率为95.12%。同样，以 S9-1基因作为标记分子，在水稻悬浮细胞上发现毒氟磷对其具有抑制活性，当毒氟磷作用20~24 h时抑制活性最明显。采用水稻悬浮细胞介导法，发现氨基寡糖素(chitosan oligosaccharide，COS)对病毒也具有诱导保护活性，对病毒抑制活性为84.84%。

2.2 病毒增殖抑制剂的发现

病毒CP在保护病毒颗粒完整性以及病毒运输等方面具有重要意义。本团队构建pGEX6p-1-P10等系列原核表达载体，采用大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)RIL等表达菌株进行CP表达，构建排阻色谱、荧光滴定、微量热泳动技术体系，用于研究基于CP的体外SRBSDV抑制药剂的筛选。该方法为高通量、快速、体外筛选直接作用于植物病毒的药剂提供了借鉴方法。

研究人员采用丙酮对棉花籽油沉淀进行活性成分分离提取，经结构鉴定为棉子酚和β-谷甾醇。多年多地的田间药效试验表明，上述提取物对SRBSDV具有一定的抑制活性。

2.3 媒介昆虫传毒阻断剂的发现

基于田间防控需要，结合“虫病共防”的防控策略，依据吡蚜酮阻断媒介昆虫传播病毒和新烟碱类系列杀虫剂降低虫口基数的机制，同时为满足田间施药场景中“速效”和“长效”等特点，本团队开发了系列传媒害虫传毒阻断剂的缓释性颗粒剂、悬浮剂和超低容量液剂等新剂型(中国发明专利：ZL200910102604.6和ZL 201210349900.8)。

3、高活性药剂的作用机制研究

3.1 免疫激活剂的机制

研究发现，经毒氟磷处理的水稻悬浮细胞和水稻叶片组织，POD、PPO和PAL活性显著增加，通过检测水杨酸(salicylic acid，SA)信号转导通路关键效应分子发现，毒氟磷通过激活 SA 信号通路具有激活效应，表明毒氟磷对水稻具有诱导保护活性。

采用label-free蛋白质定量组学进行研究，发现氨基寡糖素可诱导水稻防御蛋白表达。RT-qPCR和酶活性试验发现COS可上调防御基因和增加过氧化物酶、超氧歧化酶、过氧化氢酶的活性。结果显示，COS抑制SRBSDV的初步机理与诱导植物寄主抗性相关。

3.2 病毒抑制剂机制研究

采用荧光波谱、ITC和MST研究毒氟磷与P9-1的互作，发现毒氟磷与P9-1具有很强的亲合性，其亲和力达微摩级。将 175 位精氨酸突变为甘氨酸后，其亲合力显著降低。研究结果表明P9-1的175位精氨酸是毒氟磷的重要结合位点。因此，推测毒氟磷除了诱导植物寄主抗性的作用之外，还能干扰病毒基质的形成，从而干扰病毒的复制。

4、南方水稻黑条矮缩病防控药剂的田间应用

目前在我国南方水稻黑条矮缩病防控中大面积推广应用的病毒病药剂主要是毒氟磷(农药登记证：PD20160338)。毒氟磷在提高水稻寄主抗性、降低病毒侵染率、抑制病毒在水稻寄主体内增殖等方面具有显著的作用。

2010年，广东省雷州市的田间试验中，依据WBPH迁入时间及带毒情况，在1叶1心期、移栽前、大田分蘖初期、孕穗期进行试验，试验设30%毒氟磷WP 联合 25%吡蚜·噻虫嗪 SC、25%吡蚜·噻虫嗪SC、10%醚菊脂MG、30%毒氟磷WP、8%宁南霉素 AS 处理，于大田分蘖初期和收割前进行田间调查，结果表明，30%毒氟磷WP联合 25%吡蚜·噻虫嗪SC对该病的防控效果最好，防效分别为66.67%、73.24%；单用 25%吡蚜·噻虫嗪SC的防效分别为 50.51%、46.48%，单用10%醚菊脂MG、30%毒氟磷WP、8%宁南霉素AS的防效分别为33.33%、33.33%、17.12%(大田分蘖初期)，45.07%、43.66%、42.25%(收割前)；表明30%毒氟磷WP在单用的情况下对水稻具有保护活性，比对照药剂——宁南霉素防效要高；同时，将 30%毒氟磷 WP 与 25%吡蚜·噻虫嗪SC联合施用，能显著提高防效，比单用25%吡蚜·噻虫嗪SC的防效要高(陈卓等，2011)。此外，针对苗期感染SRBSDV的应急防控，通过组合毒氟磷、碧护、吡蚜·噻虫嗪，3次施药后，在孕穗期进行田间调查，也显示出较好的防治效果，其中，通过毒氟磷的虫病共治处理的防效可达39.9%。

5、集成创新“水稻全程免疫”抗病防病技术

本团队通过多年的研究实践，集成创新“水稻全程免疫”抗病防病技术。2013 年，云南省芒市田间试验表明，通过组合毒氟磷防病-吡蚜酮阻止传毒的措施，在苗期、移栽期和本田期3次施药，对南方水稻黑条矮缩病的防效可达 97.5%，田间测产为0.77 kg/m2，显著高于对照(0.40 kg/m2)；2013 年，福建省顺昌县田间试验表明，通过组合毒氟磷-吡虫啉拌种、移栽期和本田期喷施毒氟磷-吡蚜酮的组合措施 ，本田期防效为 66.7% ，显著高于对照(40.42%)。

经过多年的试验示范，宋宝安教授总结出“以作物健康为目标，通过合理搭配生长环境要素，水稻全程生长的全程一体化综合管护措施”，降低了水稻生长发育全过程的病虫害发生。该措施以激发植物免疫体系为核心，以毒氟磷、氨基寡糖素等植物免疫调控剂为基础，通过植物免疫激活剂的施用促进水稻健壮、防病、抗病和丰产。该技术压低了病虫害发生基数，降低了病虫害的繁殖率和种群数量，保护了自然天敌、发挥了自然控制作用，降低了化学防治次数、减少了农药用量，集成创新全程免疫防控技术与绿色防控技术，实现了防治技术的简化、防治效果的提高、防治成本的降低、农田生态的改善。通过“三位一体”模型实现了“虫病共防”的全程免疫防控(图2)。