白僵菌和绿僵菌作为防控红火蚁生物农药的潜力及前景

作者：农向群、王广君、王以燕、张 蕾、于永浩

红火蚁 Solenopsis invicta Buren 属于膜翅目蚁科（Hymenoptera：Formicidae）火蚁属，原产于南美洲的热带、亚热带地区。20 世纪 30 年代，美国发现有红火蚁侵入和扩散。随着国际贸易频繁，海运和空运使红火蚁得以跨洲迁移。21 世纪初，红火蚁先后在澳大利亚、新西兰、太平洋岛国及亚洲等十几个国家和地区出现，成为世界上最具危害性的 100 种入侵生物之一^[1-3]。我国台湾省于 2003 年首次报道了红火蚁入侵事件，大陆于 2004 年底在广东省吴川市首先发现红火蚁传入^[4,5]，之后红火蚁行踪在广东多地及香港、澳门、广西、福建等省区出现，被列入全国农业、林业和进境植物检疫性有害生物。2005 年，农业部启动了一项为期 8 年的红火蚁根除计划，成功地消灭了 7 个孤立的红火蚁种群^[6]。近 20 年来，有关部门一直在跟踪调查和采取防控措施，然而，由于缺乏天敌、繁殖力强，加上气候适宜、物流频繁等因素，红火蚁较快适应了我国南方生境，种群急剧扩张。至 2015 年，红火蚁的发生面积已扩大到 100 万公顷^[7]，截止到2022 年 6 月 20 日已扩散到 12 个省份 579 个县（市、区），比 2021 年新增 131 个^[8]，严重为害了农林业生产，威胁着生态平衡和人居安全。农业农村部等 9 个部委近期联合发布《关于加强红火蚁阻截防控工作的通知》，联手部署红火蚁防控行动，其中应用化学农药防除是最重要一个方面，而为了实现对红火蚁的可持续治理，需要引入和加强生物防治因素，加大生物制剂研发和应用。

红火蚁的危害

红火蚁有广泛的适生生境，除了在农田、林地、果园、荒地、路边广为发生之外，还在人口密集的居民区及校园内的草坪、绿化带、花坛、树基、墙角等公共地带常有发生，在地面电气的箱体内、电线和电源开关处也时有发生^[9,10]。 

红火蚁为害是多方面的。首先是对农、林业的影响，由于红火蚁种群密集、食性广泛，大量取食植物的根、茎、叶和果实，可导致作物严重减产或林木严重损失；同时，由于缺乏天敌，红火蚁种群扩张快，破坏生境中原有的生态平衡；而且，由于红火蚁攻击性强，在遭到惊扰时会叮螫人畜，导致农民、林木管理人员不愿进入田间或被迫放弃田间作业，对居民和公园游人等构成潜在威胁，被叮咬者会出现过敏反应，严重时出现休克乃至死亡；还有发现红火蚁在温暖的电气设备如变压器箱、交通信号箱、机场着陆灯、油井泵等地面上电气内部筑巢，其死亡尸体导致设备不能正常工作^[11]。不论从保障生产、经济的角度，还是从维护生态平衡、社会安宁的层面，都亟需采取有效措施遏制红火蚁进一步扩散传播和大面积发生。

近年真菌杀虫剂产品的发展

真菌杀虫剂是以昆虫病原真菌为有效活性组分，被用于农业、林业、卫生、仓储和畜禽等有害昆虫和螨类防控的微生物农药。其有效成分昆虫病原真菌是一类专性侵染昆虫、螨类等节肢动物的真核微生物，其种类多、致病力强，寄主范围覆盖节肢动物的各个目类。自 1888 年梅契尼科夫首次报道大规模生产真菌用于田间防治金龟子害虫试验以来，昆虫病原真菌在全球范围内被广泛研究，一些优良种类已被研发成为生物杀虫剂，成为对本土和入侵害虫综合治理中被重视和强化的生物防治制剂和技术^[20,21]。

白僵菌属 Beauveria（肉座菌目 Hypocreales：虫草科 Cordycipitaceae）和绿僵菌属 Metarhizium（肉座菌目 Hypocreales：麦角菌科 Clavicipitaceae）是至今研究最为深入的昆虫病原真菌类群。已知它们的寄主覆盖了绝大多数昆虫的目及科，其中白僵菌的寄主昆虫（含螨）达 700 多种，绿僵菌的也有 200 多种^[22]。国内外真菌杀虫剂研发主要集中在这 2 个属的物种或株系^[23]。

前苏联在 20 世纪 70 年代初首先登记注册了白僵菌制剂 Boverin，到 2007 年时全球注册的白僵菌产品达 63 个，几乎全是球孢白僵菌 Beauveria basiana，在全部昆虫病原真菌 171 个注册产品中占 36.8%，防治对象属于鳞翅目、鞘翅目、双翅目、半翅目（含同翅目）、膜翅目、直翅目、等翅目、缨翅目和蚤目中的48 个科，其中有 4 个为膜翅目蚁科，但均为本地蚂蚁^[24]。2015 年全球已有 13 个国家或地区注册了 83 个绿僵菌产品，有效成分菌种几乎全是金龟子绿僵菌 Metarhizium anisopliae，除了个别为蝗绿僵菌 M. acridum（较早时名为金龟子绿僵菌的蝗变种 M. anisopliae var. acridum）。这些产品的防治对象涵盖了 12 目 33 科，其中半翅目（含同翅目）最多，含沫蝉科、蚜科、飞虱科、粉虱科和蝉科，其次是鞘翅目，含金龟子科、象甲科、露尾甲科，再有直翅目的蝗科、飞蝗科和锥头蝗科，以及双翅目 5 科，等翅目 3 科，鳞翅目、半翅目、蜚蠊目和蜱螨目各 2 科，膜翅目、缨翅目和蚤目各 1 科，其中膜翅目的是土著蚁非入侵红火蚁^[25]。我们查询了国际农药协作分析委员会（CIPAC）的公布资料，截至 2022 年 9 月底，共有 79 个微生物品种或株系的产品登记注册并在有效期中，其中球孢白僵菌和金龟子绿僵菌株系分别有 5 个和 2 个，占 6.3%和 2.5%。根据美国、欧盟、澳大利亚、日本、韩国的农药登记的最新资料，共登记有球孢白僵菌产品 15株次、金龟子绿僵菌 6 株次。在英国作物生产委员会（BCPC）《世界生物农药手册》（2004 年第 5 版）中，有 86 个微生物农药在册，含球孢白僵菌和金龟子绿僵菌的有 2 个和 4 个。可见，球孢白僵菌和金龟子绿僵菌的注册产品是目前真菌杀虫剂的主导产品，防治对象为各种农林、卫生害虫，但尚无以红火蚁为靶标的微生物农药注册产品。

20 世纪 50 年代我国开始系统地开展利用白僵菌防治大豆食心虫 Leguminivora glycinivorella、油松毛虫 Dendrolimus tabulaeformis、亚洲玉米螟 Ostrinia furnacalis 等害虫的研究，也开展了利用绿僵菌防治金龟子、天牛、叶甲等鞘翅目害虫以及白蚁、蟑螂等害虫的研究，从菌株选育到发酵生产和产品制剂研发形成了较完整的工艺，生产达规模化水平。广东省标准计量管理局于 1985 年 1 月发布了《白僵菌粉剂企业标准》和《白僵菌生产企业标准》^[26]，企业生产产品一直是在农业或林业部门系统内大面积推广应用，但是一直未有注册登记的商品。2002 年首例真菌杀虫剂绿僵菌杀蟑饵剂产品得到注册（证号 LS20021110，现登记号 WP20090077），随后用于防治蝗虫的绿僵菌母药和油悬浮剂也获得批准（证号 LS20041884 和LS20041885，现登记号 PD20080670 和 PD20080671）。《真菌农药母药产品标准编写规范》等 5 项系列国家标准（GB/T 21459.1～5 —2008）发布，有力地推动真菌农药产品标准化和注册登记，2010 年发布白僵菌产品的国家标准《球孢白僵菌粉剂》（GB/T 25864—2010），第一例登记的白僵菌产品问世。当前我国登记在册的真菌生物杀虫剂产品（不包括杀线虫剂）有 55 个，其中球孢白僵菌和金龟子绿僵菌分别为30 个和 17 个，其比例为 54.5%和 30.9%；这两类产品的剂型都有母药 TK、可分散油悬浮剂 OD、悬浮剂SC、可湿性粉剂 WP、颗粒剂 GR，此外白僵菌有水分散粒剂 WG，绿僵菌有饵剂 RB 和油悬浮剂 OF。这些产品的防治对象有多种重要农林害虫和卫生害虫，如松毛虫、玉米螟、稻飞虱、地老虎、蛴螬、蜚蠊、草地贪夜蛾等，尚未包括红火蚁。

白僵菌和绿僵菌对红火蚁的毒力与防效评价及存在问题

虽然白僵菌和绿僵菌的寄主昆虫范围都包含膜翅目蚁科（Hymenoptera：Formicidae）蚂蚁，然而，在真菌生物杀虫剂发展的 130 多年中，很少用于蚂蚁防治的研究。近 40 年来红火蚁入侵范围及危害程度急剧增加，对红火蚁的病原微生物资源及其生物防治利用受到广泛关注。20 世纪 70 年代，美国科学家在南洲和美国东南部调查了红火蚁的天敌和病原微生物，报道了病原体微孢子菌 Thelohania solenopsae 和金龟子绿僵菌^[27]，后来更广泛地调查发现球孢白僵菌和微孢子菌类的变形孢菌 Vairimorpha invictae 也是红火蚁的病原^[28]，此外通过分子技术发现并鉴定了感染红火蚁的病原病毒 Solenopsis invicta virus-1^[29]及一种新的卵形目原生动物 Mattesia sp.^[30,31]。由此研究者们开展了虫生真菌对红火蚁毒力测定及防效评价，以期研发成为有效防控红火蚁的生防制剂。

田间评价白僵菌和绿僵菌菌株对红火蚁的防治效果

在明确白僵菌和绿僵菌菌株对红火蚁致病性的基础上，研究人员在田间开展了防控效果评价试验，有的还对菌剂进行了改善以提高应用效果。

在美国，对从巴西红火蚁分离的球孢白僵菌菌株 Bb447（ATCC20872）进行室内评价，并确定其对红火蚁具有高致病力，再用稻米培养产生大量分生孢子，然后直接作为菌剂进行应用^[44,45]。以菌株 Bb447 10⁸孢子/mL 悬浮液对红火蚁直接喷洒，导致接近 100%死亡率，其中 88%尸体中是由真菌感染致死^[46]。然而，在美国佛罗里达州牧场的防控红火蚁试验中，将稻米培养的白僵菌 Bb447 孢子施用到蚁丘顶部，然后采样检测红火蚁感染率最高只有 55%，在 8 周内菌剂处理的蚁丘有 70%仍为活蚁巢或发生蚁巢迁移，在附近形成活的新蚁丘。采用加压喷射菌粉的方法分别在深秋和次年初夏时节将孢子粉施用到红火蚁蚁丘中，处理后调查蚁丘中活蚁的感染率，表明在第 5 d 感染率达峰值，分别为 60%和 52%；处理 5 周后恢复至对照水平；处理 8 周，所有喷粉处理蚁丘均为活蚁巢或迁巢形成新蚁丘；在喷菌区域内，红火蚁工蚁觅食活动显著减少，其他蚁类的觅食活动增强^[47]。以上防效试验说明，在田间施用高毒力菌株菌剂能够达到一定防治效果，但受到田间某些因素的制约，总体防效不理想，没达到减少蚁巢的目的。

在田间应用球孢白僵菌防控红火蚁的持效性方面，在黏土和沙土筑成的蚁巢中，施用白僵菌 150 d 内，从巢内土壤均可检测到菌落，黏土中的菌落数（CFU）高于沙土的 3～30 倍；在黏土蚁巢中，处理 120 d的菌落数平均为 2.14×10⁶ CFU/g；在沙质土壤中每巢施菌 12.5～200 g 的不同处理平均防效在 67%～100%，平均为 80%^[48]。

除直接将孢子施用到蚁丘中，白僵菌诱饵配方也用于开发和试验，如含引诱剂的干菌粉可增加红火蚁与菌剂的接触机会，促进孢子在虫体表皮角质层萌发侵入^[49]。将球孢白僵菌菌丝体或分生孢子用海藻酸钠包裹呈小球状，然后干燥，再在小球外覆上花生油，制成一种小球状的颗粒剂。在播撒菌丝颗粒剂的小区中，红火蚁的蚁群活动显著减少^[50]。在红火蚁严重发生地区，将海藻酸盐包埋的菌丝颗粒剂直接施入蚁丘中，可降低蚁丘中红火蚁活跃度，但观察到红火蚁在施菌后不久就会把菌粒从蚁丘中移走，而覆有花生油的菌粒则不被清运出来，显然仍被保留在蚁丘中，能够产孢和感染红火蚁^[51]。在美国德州的两季（1997―1998 年）田间试验中，播撒白僵菌的藻酸盐颗粒剂导致红火蚁种群数量的等级显著地低于对照；施用加有花生油的菌粒可大大提高红火蚁对菌粒的搬运及召集频次，在处理区可查到感染球孢白僵菌的红火蚁个体^[52]。

在台湾球孢白僵菌高毒力菌株也被用于田间红火蚁防治试验，施菌和投撒饵剂均可显著地提高防效，而且施菌处理于红火蚁土丘的灭巢效果优于饵剂处理^[53]。在广东番禺，田间试验评价筛选的高毒力菌株ZGNKY-5，设置 100 mL、250 mL、500 mL、750 mL 和 1000 mL /巢 5 个剂量处理，在两个低剂量处理中，处理后第 4 d 的工蚁数量与对照无显著差异，在第 10、20、30 d 其工蚁数量比对照显著下降；在 3 个较高剂量处理中，第 4 d 及其他时段的工蚁数比对照均显著下降，而且菌剂剂量越高，下降率越高，说明高剂量能达到有效的防控作用^[43]。

关于利用绿僵菌防治红火蚁的田间试验相对较少。最近报道了一种采用以明胶为载体的金龟子绿僵菌微胶囊剂，微球直径为 35～50 μm，囊化条件为壁材 1%，明胶与阿拉伯胶比例为 1:1～1:2，芯壁比为 1:1。与无囊化的分生孢子菌剂相比，微囊化的分生孢子制剂能够抗紫外线和具有更长的货架期；试验表明制剂对红火蚁有明显的抑制作用^[54]。

在田间条件下，除了虫生真菌菌株、制剂类型、施药方式及环境因素对红火蚁田间防效有影响外，土壤、红火蚁蚁群卫生行为和工蚁哺幼行为也对防效有影响。直接喷洒白僵菌分生孢子到红火蚁虫体上，无论将红火蚁置于干净的塑料杯，还是置于有灭菌土壤或非灭菌土壤的塑料杯中，红火蚁的死亡率都相似。然而，掺入分生孢子到灭菌土壤和非灭菌土壤中，前者处理中浓度为 10⁶ 孢子/g 土壤，红火蚁死亡率达 90%，后者处理中，红火蚁死亡率很低，当增加浓度至 10⁸ 孢子/g 土壤，死亡率才略高于 50%。以 3×10⁷孢子/g土壤处理非灭菌土壤，3 d 后从土中移出红火蚁，其死亡率仅为 15%，而一直留在土壤中的红火蚁在 15 d时死亡率只有 4%^[46]。这些结果说明土壤中存在拮抗物质可能抑制白僵菌，从而降低其对红火蚁的侵染率。

红火蚁的取食过滤能力和蚁群卫生行为限制病原真菌传播。解剖、显微镜检查和组织分离培养表明，工蚁能够从取食的液体诱饵中过滤掉白僵菌分生孢子，并收集在口腔中；在土壤施入白僵菌分生孢子后，蚁群不会遗弃这些作为巢穴的土壤，但蚁群的死亡率也不会因此而增加，因为巢穴中受感染的红火蚁个体会被同伴工蚁从蚁群中移走，在真菌孢子形成之前被搬运到巢外弃尸堆中，从而减少其他个体被感染的机会^[55,56]。红火蚁是社会性昆虫，具有自我梳理和相互梳理体表的习性，当感染金龟子绿僵菌孢子后，单头隔离的红火蚁工蚁自我梳理更频繁，在与 4 头健康工蚁同组饲养时则获得更多的相互梳理；当采用异硫氰酸荧光素（FITC）标记分生孢子进行荧光显微计数，表明感染工蚁与健康工蚁同组的工蚁角质层上的分生孢子数量明显地比单头隔离饲养的减少得更快。说明相互梳理行为似乎可以去除红火蚁表面的病原真菌孢子。这种密集梳理行为看似个体冒着自身被感染的风险，实际上可让整个蚁群获得社会性免疫，从而提高巢内伙伴的群体免疫水平，也降低了对病原真菌的敏感性^[57]。

可见，为了利用昆虫病原真菌防治红火蚁取得良好防效，不仅需要高毒力菌株为基础，还需要根据红火蚁习性和生境，在剂型和使用方法上使菌剂尽量覆盖蚁巢或接触到出巢的工蚁，并克服环境不利因素和红火蚁自清洁作用，以保障菌株田间侵染效力。

讨论与展望

至今研究证明白僵菌和绿僵菌中确实存在对红火蚁的高致病力菌株，为红火蚁微生物防治提供了可能，而且白僵菌和绿僵菌在农林害虫防治上已有商品化制剂和成功应用的实例，为针对红火蚁制剂的研发和应用提供了借鉴。

微生物农药研发过程中，优良菌种是首要的物质基础，优化发酵工艺是规模化生产所必需，剂型化使产品实用化，产品注册登记是商业化的前提，适应靶标特性的应用方法是取得良好防效的关键。目前，利用白僵菌和绿僵菌防控红火蚁的研发还处于初期阶段，尤其在剂型和应用方法上面临诸多挑战。

如上所述，通过生物测定已筛选获得了一些对红火蚁高毒力菌株，然而有关提高毒力、增强抗逆性等遗传育种研究还很少见，可借鉴对农林害虫菌株的改良，如将球孢白僵菌毒力高的菌株与耐热性强的菌株通过细胞电融合技术促进原生质体融合，获得同时具备高毒性和耐热性的融合株^[58]；将苏云金杆菌杀虫基因 Vip3Aa 转化球孢白僵菌，导致对马尾松毛虫的致死率比原始菌株提高 30%以上，而且喂食处理比喷雾处理的致死率更高，死亡更快，创造出既有体壁侵染优势又有胃毒作用的白僵菌工程菌株^[59,60]。

在规模化生产方面，虽未见专门针对红火蚁菌株的报道，但完全可以参考或遵循其他菌株的发酵工艺，再进行参数优化。目前，防治农林害虫的白僵菌或绿僵菌产品多是采用液-固两相工艺获得分生孢子，液相过程主要是实现液体种子快速扩增，可通过多因素组合设计和借助自动控制发酵系统优化发酵参数，以获得最高生物量以及最有利于后继固相发酵的分生孢子产生^[61,62]。固相过程进一步扩繁了菌丝体，并促进菌丝体转化为分生孢子。固相培养基质的载体有营养基质（如麦粒、米粒、稻壳加糠麸混合物）、非营养基质（稻壳、锯末、蛭石等）和无纺布。根据菌株、基质不同，固相培养的具体参数包括碳氮补充、无机盐补充、料水比、温度和通气量等都需要进一步优化，以获得高产的分生孢子粉^[63,64]。

将孢子从发酵基质分离提纯成孢子粉和加工成制剂主要是为了便于贮存运输、延长产品货架期、适于不同器械及环境施用、提高田间防治效果，并且形成产品的规范标准以达到农药注册登记的要求，才能实现商业化。作为微生物活体，白僵菌和绿僵菌对环境因子（如温度、湿度、紫外线等）较为敏感，其活力在贮存期间或田间施用后可能衰减。通过制剂可以在一定程度上缓冲环境因子对菌体的胁迫，保护菌剂的贮藏稳定性和杀虫活性，在制剂方面还需要更深入细致的优化和改进^[65]。如前所述，目前主要用直接发酵产品粉剂或制成胶囊的颗粒剂进行红火蚁的田间防效评估，尚未见以红火蚁为防治对象的白僵菌或绿僵菌注册产品。

在施菌方法方面，红火蚁生物学特点及菌剂中白僵菌或绿僵菌的活体特点是影响田间防治效果的关键因素。一方面，红火蚁是一种典型的社会性昆虫，不仅有社会分工，而且其蚁群数量极大，每巢有几万至几十万头，巢内结构精巧复杂，使得药剂很难全面覆盖整个蚁巢；另一方面，环境因素如高温、阳光、土壤中拮抗物质等会影响白僵菌和绿僵菌的生活力，因此施用菌剂要尽快、尽量接触到靶标害虫红火蚁。借鉴《红火蚁化学防控技术规程》（NYT 2415-2013）有 3 种田间施药方法，即毒饵诱杀法、药液灌巢法、撒施灭巢法。毒饵诱杀法是根据红火蚁工蚁觅食习性，将含有引诱材料的杀虫饵剂以点施或撒施方式投放在红火蚁发生区域。药液灌巢法是将需稀释施用的药剂（如 WP、EC）配成一定浓度的药液，以活蚁巢为中心，先在蚁巢外围近距离淋施药液，形成药带，再将药液直接浇在蚁丘上或挖开蚁巢顶部后迅速将药液灌入蚁巢，使药液完全浸透蚁巢。撒施灭巢法是将可直接使用的药剂（如颗粒剂、粉剂）均匀撒布于蚁丘表面和附近区域，并迅速洒水将其冲入蚁巢内部；施用粉剂还可以先破坏蚁巢，待工蚁大量涌出后迅速将药粉均匀撒施于工蚁身上，通过带药工蚁与其他蚁之间的接触，传递药物，进而灭杀全巢^[66]。这 3 种方已充分考虑了红火蚁的习性特点，但仍然很难达到理想的防治效果，残存活蚁通常会迁移再建新巢。相对于化学药剂，白僵菌和绿僵菌对红火蚁侵染致病作用需要较长的时间，在环境中还可能因遭受环境因子胁迫而失活，但活菌体具有可增殖、可扩散传播的优势，如果有一定数量定殖在红火蚁生境中，将可能实现长效的生态自然控制。如何扬长避短，促进白僵菌和绿僵菌发挥优势作用，可能是未来研发的工作重点。从剂型和施用方法上看，在蚁丘和周边环境施用粉剂或含引诱功能的饵剂是适用的，因为工蚁觅食过程可沾染菌剂以及搬运含菌饵料可将菌体带入巢中，交哺幼蚁的习性可能促进菌剂在个体间和蚁巢中扩散。然而，红火蚁进化出了许多对抗病原体的策略，包括生理上的免疫相关酶反应、产生抑菌毒液等^[67,68]，还有工蚁的自我梳理和互相梳理行为以及清洁蚁巢行为都可能回避了白僵菌、绿僵菌的沾染和侵入^[56,57]，这些也是研发剂型和改进施用方法时需要探索和解决的问题。随着人们对红火蚁生物学和病理学的深入研究，相信在不久将来，白僵菌、绿僵菌的实用产品能够在红火蚁防控中体现积极作用

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