植物干细胞生物合成技术——推动植物源农药产业高速发展

植物中富含碳水化合物、蛋白质和脂肪等营养物质，同时也含有大量次生代谢产物。其在药品、香料、染料、色素、杀虫剂、食品添加剂等领域具有悠久的应用历史^[1]。长期以来，植物资源己经成为人类赖以生存的食物与药品的重要资源之一。植物次生代谢产物是植物体中存在的一大类非生长发育所必需的小分子有机化合物，但在植物抗逆及抵御病虫害等方面发挥着重要作用。

目前已报道的植物次生代谢产物主要包括生物碱、黄酮类、醛类、木脂素等，其种类达到数万种以上。目前，部分次级代谢产物已被开发成商业化产品，具有广阔的社会需求与重要的应用价值。例如，青蒿素被用于痢疾的治疗，紫草素用于抗菌，香兰醛、玫瑰油用作香料，除虫菊素、苦参碱、藜芦碱用作杀虫剂，蛇床子素、香芹酚、小檗碱等已被广泛用于农业病害的防治。

随着对新品类药用植物的研究以及先进技术的投入，越来越多的具有高生物活性的新型药用植物次生代谢产物相继被发现，对植物资源的需求正不断增加。除野生采集外，药用植物的人工栽培仍是目前提供原材料的主要途径。人工栽培对植物种子、土壤、气候条件等要求较高，栽培过程中易感染病害、部分药用植物栽培时间长、管理成本高。同时，药用植物栽培与农作物栽培的争地矛盾日益突出^[1]，高活性植物次生代谢产物供需关系紧张^[2]。

而利用植物干细胞生物反应技术对经诱导生成的植物单细胞进行大规模集中离体饲喂，以大量获得高活性目标代谢产物是目前解决药用植物资源问题的有效途径。

一、植物干细胞概念及发展

植物组织培养与细胞培养开始于19世纪后半叶，在Schleiden和Schwann创立的细胞学说基础上，1902年德国植物生理学家Habedandt提出了著名的″植物干细胞全能性″论点^[3]，认为植物干细胞具有在体外发育成完整植株的能力。但直到1934年，White^[4]使用离体的番茄根部建立了第一个活跃生长的无性系，才使根的离体培养试验首次获得了真正的成功。二十三年后，Skoog和Miller^[5]发现，激动素可以有效地促进外植体的细胞分裂和芽再生。其中最重要的是，高激动素/生长素比例诱导芽的发生而低激动素/生长素比例促进根的发生。这一发现奠定了植物组织培养中再生和细胞工程的基础，揭开了激素调控植物器官再生的秘密面纱。Muir等人^[6]利用万寿菊愈伤组织建立了首个植物干细胞悬浮系。他们通过愈伤组织哺育方法成功地观察到单个细胞可以分裂形成小的细胞团。1958年，Steward等人^[7]将胡萝卜根韧皮部的细胞进行离体培养，发现这些细胞失去已分化细胞的结构特征并发生反复的细胞分裂，最终形成胚胎并发育成具有根、茎、叶等器官的完整植株。同年，德国科学家Reinert^[8-9]也获得了类似的研究结果。此后，经过研究人员50余年的不断验证，植物干细胞的全能性已经得到充分验证。

图1. 不同品种的植物干细胞

二、植物干细胞生物反应技术

与常规的栽培技术相比，植物组织和细胞培养进行药用植物目标次生代谢产物的生产具有显著的优越性。^[10]与栽培植物不同，植物干细胞生物反应技术使用工业化反应器生产系统及配套回收工艺，在自动控制系统的加持下，可实现全年不间断运转。不受土壤环境、气候条件、生物及非生物胁迫的影响。全培养周期无菌环境控制，无需使用农药防治病虫草害的侵扰。同时，植物干细胞生物反应所供给的基础营养成分价格低廉，与哺乳动物、昆虫、酵母细胞培养体系相比，成本效益更加显著。

在作为生物合成底盘细胞方面，植物干细胞合成植物源天然代谢产物具有先天的优势。与细菌不同，植物干细胞作为真核系统，它们具有正确折叠和组装多聚体蛋白质的能力。此外，植物干细胞能够进行在许多原核生物中很少发生的蛋白质翻译后修饰，为生物合成通路调节增添了更多可能性。植物干细胞在对目标产物进行生物合成时，不会产生细菌毒素，合成系统安全性更高。另外，植物干细胞包含复杂的内膜，能够顺利表达需定位于质体系统的原生生物合成过程关键蛋白酶。

表1. 不同生物合成底盘情况对比

植物细胞遗传转化方法成熟稳定，随着新基因编辑工具的发展，异源基因的表达调控不再困难。通过对代谢途径的研究，实现对目标产物生物合成路线关键基因、限速酶进行遗传操作，提高目标产物生物合成量。亦可利用基因工程技术探索或人工创造全新生物合成路线，获得本底细胞地盘品种不具备合成能力的其他目标代谢产物。将底盘细胞的优势及目标代谢产物合成能力相结合，大幅提升产量。同时，通过生物反应转化作用，能够将价值较低的前体物质转化为高价值目标产物。植物干细胞生物反应技术作为解决资源问题的有效途径而成为了当代生物技术的重要发展领域之一。

图2. 植物干细胞生物反应

作为生物合成底盘，植物干细胞展现出了其独有的优势。转基因或基因编辑工程细胞并非完整的植株品种，面临更少的法规监管上问题。但是，非模式植物原生干细胞获取具有不确定性，高度复杂的代谢网络调控机制也给生物合成工作带来了前所未有的挑战。

表2. 植物干细胞生物催化合成案例^[13]

三、植物毛状根生物反应技术

植物材料生物反应工厂中最常用的生产系统是干细胞悬浮培养。然而，在特殊情况下，未分化的组织中可能无法产生某些特定次生代谢产物，或某些植物次生代谢产物的合成高度依赖于特定的组织器官时，毛状根生物反应技术提供了另一种解决方案。毛状根生物反应技术是利用发根农杆菌浸染植物，使植物产生毛状根。

图3. 植物毛状根生物反应

该技术不需外源生长调节剂和额外光源，生长迅速、分支多、特定次生代谢物质含量远高于细胞悬浮培养含量。毛状根生物反应同样也受营养成分、诱导子、前体和基因操作等因素的影响，是目前被认为最好的获得植物次生代谢产物的原材料之一。

表3. 植物毛状根生物催化合成案例^[13]

目前，使用毛状根生物反应技术作为生物合成转化的适合材料，正在获得超越植物干细胞培生物反应的优势。它们具有许多优点，包括生化和遗传稳定性、对培养条件变化的敏感性较低、酶潜力与亲本植物非常相似和低成本。

四、植物干细胞培养发展现状与研究进展

1. 全球产业化现状

多年来，通过植物干细胞生物反应技术生产药用成分取得了很大的进展。目前已经研究过的植物有400多种，能够生产超过600多种的初级、次级代谢成分，其中有相当大部分具有药用价值，部分已成功实现工业化生产。早在1956年，美国Routier和Nickell就提出了从植物干细胞培养合成天然产物的专利^[10]。日本三井石油化工公司于1983年宣布将紫草宁作为染料和药物进行工业化生产，此外，从毛地黄细胞培养物通过生物转化生产地高辛，黄连细胞培养物生产黄连碱，人参根培养生产人参皂苷等均实现了工业化生产。其他如长春花和彩叶紫苏等细胞培养，也达到中试水平^[12]。通过红豆杉干细胞培养技术，紫杉醇生物合成量达到了1045mg/L,较亲本植株提升超过298倍。积雪草总苷类合成量达到1670mg/g DW,已完全满足产业化需求。比利时Green2chem公司以及法国Naturex等公司积极利用植物毛状根生物反应技术，成功实现了诸如烟碱、西利马林、紫杉醇、奎宁、佛司可林等20余种高价值药用成分的生物合成。在中国，纽兰生物将植物细胞微囊泡作为药物递送介质开展研究，截至2018年，该公司完成了天使轮融资，已建成吨级以上植物干细胞生物反应设备。2022年初，美国Phyton公司投资30亿元在徐州开工建设PCF植物干细胞生物反应″超级工厂″，建成后预计销售收入达70亿元。

2. 生物合成助推植物源农药产业高速发展

不积跬步，无以至千里。成都新朝阳作物科学股份有限公司（以下简称″新朝阳″）成立二十余年来，始终专注于农业绿色发展，是行业领先的植物源生物农药科技企业。植物源农药有效成分多为天然高活性次级代谢产物，其具有降解速度快、环境相容性好、低残留等特点，符合当下环保发展潮流，市场需求量持续增长。但随着产业化进程的推进，药用植物资源问题即将成为高活性天然产物运用的技术瓶颈。

图4. 植物干细胞生物反应技术基础路线

新朝阳公司通过愈伤组织诱导，植物干细胞悬浮培养，毛状根诱导等植物干细胞培养技术，开展植物干细胞生物反应技术研究，目前已获得重要进展。

图5. 基因工程植物干细胞生物反应阶段性成果

新朝阳通过植物组织干细胞诱导技术，目前已获得超过10余种具有生物合成开发潜力的植物底盘细胞材料。经过生物反应条件优化，目前干细胞产量已达到550g/L。通过基因工程技术，成功实现了目标代谢产物的底盘异源表达，完成了多个工程细胞的代谢通路关键基因重组构建。并成功实现了目标代谢产物的生物合成小试技术研究。为目标天然产物品种产业化技术目标推进顶定了坚实基础。

五、植物干细胞生物反应技术展望  

长期对珍稀药用植物的盲目采集致使生态环境遭到破坏，许多野生植物濒临灭绝，一些特殊生态环境下的植物引种困难，能够引种栽培的植物则需要占用大量的农田，在耕地面积日益减少及保证18亿亩耕地红线的制约情况下，药用植物的大规模种植受到严重制约。此外，人工栽培受环境因素的制约，天然植株中目的次生代谢产物含量过低，成分复杂又给产业化利用构建了极高的开发成本壁垒。天然高活性药用产物结构复杂，手性中心数量多，传统化学合成技术已无法满足生产技术需求。面对上述诸多难题，科学工作者通过探索高等植物干细胞、器官等的大量培养技术，生产有用的次生代谢产物^[14-16]，具有极大的社会意义。

据《中国植物源农药行业竞争现状分析及企业投资策略研究报告》显示，中国是全球农药生产和使用大国，而生物农药（含农用抗生素）占农药总量的比例不足12.5%，远低于国际平均水平。生物农药受国家政策支持，符合当下环保消费潮流，市场增速快。植物源农药作为生物农药的关键种类，具备广阔的发展前景。

新朝阳作为一家从事原创生物技术研发的生物农药科技企业，通过植物干细胞生物反应技术的创新突破，致力于解决植物源农药产业化的瓶颈，为保护生态环境和促进农业绿色发展做出贡献。未来，新朝阳持续以作物为科研导向，持续提升植物源农药的防治效果和降低应用成本，推动植物源农药产业高速发展。

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