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BSM CHEMICAL CO.,LTD

RNA生物农药的商业化现状及存在问题

2022-11-18
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来源:《中国农业科学》2022年第15期

作者:关若冰1,2,李海超1,2,苗雪霞2*(1.河南农业大学植物保护学院;2.中国科学院分子植物科学卓越创新中心昆虫发育与进化生物学重点实验室)


摘要:RNA生物农药是利用RNA干扰(RNA interference,RNAi)原理,通过抑制生物体重要功能基因的表达,造成有害生物发育停滞或死亡,进而达到病虫害防控的目的。该技术不会改变有害生物的基因组,也不会对生态系统造成不良影响。由于RNA生物农药具有精准、高效、绿色无污染等优势,受到了植物保护专家的重视,将其称为″农药史上的第三次革命″。近年来,随着拜耳公司表达昆虫dsRNA的抗虫玉米MON87411获得多个国家的安全证书,引起各大传统农化公司投入大量人力物力进行布局和产品开发。此外,还吸引了资本市场的关注,涌现了一大批基于RNAi技术进行病虫害防控的新兴公司,极大地加速了RNA生物农药的产业化步伐。随着RNA生物农药的快速发展,必将改变全球农药市场格局,这无疑是一种新的挑战。尽管我国在该领域的研发起步较早,起点也很高,但是,大多数研究主要集中在基础理论,而应用开发相对薄弱,已经远远落后于国际同行。与传统农药相比,RNA生物农药无论是作用机理还是应用开发,均有其独特之处,亟需监管部门建立匹配的研发、应用、生产等技术标准。完善相应的法律法规,对生产进行监督指导,促进我国RNA生物农药的快速发展,降低国际农药巨头在该领域形成技术垄断的风险。

01

RNA干扰技术应用研究进展


RNA干扰(RNA interference,RNAi)机制自1998年发现以来,已经被广泛应用于基因功能、生物医药以及农作物病虫害防控等领域。RNAi技术通过特异性抑制靶标基因的表达,导致与目标基因相关的生理功能缺失,或形成功能缺陷,从而对靶标基因功能进行分析研究,尤其是在基因敲除、基因编辑平台不太成熟的非模式物种中,该技术极具优势。


在生物医药领域,自RNAi技术被发现以来,就被众多医药巨头给予极大的关注,并在此领域进行了规模庞大的布局,同时涌现很多基于RNAi技术成立的医药科技公司,使得这一技术在生物医药领域呈现暴发性的发展。2018年,Alnylam公司开发的全球首款RNAi药物patisiran获得美国食品药品监督管理局(U.S. Food and Drug Administration,FDA)上市许可,这是全球第一款RNAi药物,主要用于治疗成人遗传性转甲状腺素介导淀粉样变性引起的多发性神经病变,该疾病每年治疗费用高达34.5万美元。随后,在2019年和2020年,同样由Alnylam公司开发的第二款、第三款RNAi新药分别上市,这3款药物均为针对罕见病治疗的孤儿药。2020年12月,欧盟批准了诺华公司研发的用于治疗原发性高胆固醇血症的RNAi药物inclisiran,实现了RNAi药物从罕见病到常见慢性疾病的飞跃,该药于2021年12月获得美国FDA的上市许可。这些新药的出现,改变了现有医药研发的格局,同时再次触发了各大医药公司对该领域的投资热情,仅2021年,全球RNAi疗法领域发生64起投融资事件(含IPO,initial public offering,首次公开募股),总金额超50亿美元。此外,还有46项RNAi药物的合作交易发生(见2021年全球RNA疗法领域投融资年报)。


在农业领域,RNAi技术同样被寄予厚望,尤其是在病虫害防控领域,被称为″农药史上的第三次革命″。利用RNAi技术沉默有害生物生长发育过程中重要基因的表达,导致其生长发育障碍或者死亡,从而降低有害生物对农作物的侵害,实现病虫害防治,达到农作物安全生产的目的。利用RNAi技术进行病虫害防治具有防治目标专一性、靶标开发的便捷性、应用方便易于操作、绿色无污染、无残留及环境兼容性强等众多优势,完全符合公众对于绿色农药的需求。在RNA生物农药研发领域,目前已经有产品上市或准备上市。拜耳公司的第一款表达昆虫双链RNA(double-strand RNA,dsRNA)的抗虫转基因玉米于2017年获得美国环境保护署(U.S. Environmental Protection Agency,EPA)的种植许可,2021年获得中国农业农村部转基因安全许可证书,预计2022年推广上市;同时,多款基于喷洒的RNA生物农药已经提交或者准备提交EPA审核。


我国在利用RNAi技术进行病虫害防治领域的基础研究中,起步较早、起点较高,但是在应用领域,由于缺乏规模化、系统化的研究投入,目前,与国际农化巨头的研究还存在一定的差距。在此背景下,迫切需要我们在该领域加快研究步伐,同时建立与RNA生物农药相匹配的研发、应用、生产等技术标准,完善相应的法律法规,对生产进行指导与监管,以此来促进RNA生物农药的商业化进程。基于此,本文就目前国际RNA生物农药公司的研究及开发现状,以及一些国家对于RNA生物农药相关政策进行综述,为RNA生物农药发展形势及政策解读提供参考。


02

RNA生物农药商业化进程


2.1  国际上主要从事RNA生物农药研发的公司及其发展现状


自RNAi现象被发现以来,20余年的实践证明,各大农药公司对于RNA生物农药的研制经历了快速入场、瓶颈期撤离、技术突破后再次入场及高速发展等几个时期。1998年,RNAi技术一经发现,国际上几大农药公司,如拜耳、孟山都、先正达、巴斯夫等均投入大量的人力和财力开始了RNA生物农药的开发以及应用研究,掀起了RNA生物农药研发的第一波热潮。但是,由于dsRNA生产、递送及保护技术尚未解决,从2010年到2018年,大量资本纷纷离场,RNA生物农药的研发经历了相当长时间的低谷期。近年来,随着RNAi药物研发的蓬勃发展以及相关技术的突破,针对RNA生物农药的研发也进入了快速发展时期。目前,拜耳(孟山都)在转基因玉米(MON87411)以及喷洒型RNA生物农药(BioDirect)应用研发方面,均取得了非常显著的成果,基本实现了商品化。先正达在利用RNAi技术进行病虫害防控方面也取得了极具商业价值的成果。同时,一些新兴农化公司及大量资本也加入到RNA生物农药开发的行列,极大地促进了RNA生物农药的研发及商业化进程。


2.1.1  dsRNA生产相关公司概况


成立于2008年的Greenlight Biosciences,主要致力于人类健康和农用RNA产品的生产和研发。该公司建立了多种平台的dsRNA生产工艺,其专有的无细胞生产系统,能够将dsRNA的生产成本控制在1美元/g的价格,并且能够保证生产dsRNA的技术级活性成分(technical grade active ingredient)。该公司目前有多款抗病、抗虫的RNA生物农药产品在积极研发,并准备或已经提交EPA审批。公司因拥有较为成熟的RNA生产平台,近年来得到资本市场的广泛关注,从2013年至2020年,获得数亿美元融资,其中2020年6月16日,D轮超额认购融资1.02亿美元,成为2020年度全球农业技术领域融资排名第二的投融资事件;2021年5月20日,拜耳将其防治蜜蜂狄斯瓦螨(Varroa destructor)的RNAi相关专利与Greenlight Biosciences共享,授权该公司进行dsRNA合成;2021年9月21日,该公司宣布其在纽约罗彻斯特的制造工厂开业,投入使用后,预计dsRNA的年产量可达100吨级规模;2021年8月10日,Greenlight Biosciences在无任何产品商业化的背景下,与SPAC Environmental Impact Acquisition Crop完成12亿美元并购,在纳斯达克上市。Greenlight Biosciences表示,该交易从SPAC获得2.82亿美元以及1.05亿美元的PIPE(上市后私募投资,private investment in public equity)融资。这些收入将用于开发基于RNA的杀虫剂、流感候选疫苗以及其他未被满足的医疗需求,该公司预计在2022年推出首款产品(https://greenlightbiosciences.com/)。


美国另外一家专门从事dsRNA高效、经济、大规模生产的公司RNAgri,宣称其dsRNA合成平台能够将dsRNA的生产成本控制在1美元/g,该公司于2020年6月18日被RNAissance Ag LLC收购。RNAissance Ag LLC是2019年1月24日由投资公司TechAccel LLC(https://techaccel.net/)和Donald Danforth Plant Science Center共同成立的子公司,专门开发针对小菜蛾(Plutella xylostella)的喷雾式RNA生物农药。2021年,由TechAccel LLC在圣路易斯建立新的办公室(TechAccel LLC和RNAissance Ag共同使用),用于RNA生物农药相关的小规模实验研发、生产、发酵(https://www.rnaissanceag.net/)。


韩国的Genolution公司开发出一种有效程序,通过发酵平台合成毫克(mg)至千克(kg)规模的dsRNA(200~800 bp)(http://genolution.co.kr/)。此外,总部位于加拿大温哥华的Renaissance BioScience公司建立了以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)发酵生产dsRNA的技术平台,通过在酵母中表达针对不同物种靶标基因的dsRNA,用于害虫防控。2021年9月,该公司宣布,基于喷洒的针对马铃薯甲虫(Leptinotarsa decemlineata)的RNA生物农药产品,在一项独立测试中对幼虫的致死率达到98.3%,大大降低了马铃薯甲虫对作物造成的损害(https://renaissancebioscience.com/)。


上述公司的主要优势均集中在dsRNA的生产上。通过这些公司的不断开发,dsRNA的生产成本从2008年的12,000美元/g降到了2021年的1美元/g。通常情况下,dsRNA的使用量非常低,每英亩(约0.4公顷)仅需1~5 g。由此看来,目前的dsRNA生产成本已经完全能够满足商业应用。解决了dsRNA的大量生产和价格问题,预示着RNA生物农药商业化应用的根本问题得到了有效解决。


2.1.2  dsRNA递送研发相关公司概况


dsRNA在环境中的稳定性对于RNA生物农药的应用至关重要。目前已有多家公司专注于解决该问题,并开发出了独特的RNA包被及制剂平台。例如,初创公司AgroSpheres开发了一种专有的生物颗粒平台,该平台由缺乏染色体的小型球形细胞组成,可以封装dsRNA,从而减缓dsRNA的降解,同时增强其在病虫害中的传递(https://agrospheres.com/)。近年来,AgroSpheres已经获得多项融资,并与几家大型全球公司建立合作伙伴关系;NanoSUR公司开发了一个专有平台来改良生产的dsRNA,通过一定的包被,使其成为MdsRNA,能够提高跨膜效率,防止其被快速降解,进而提高RNA生物农药的效率(http://www.nanosur.com/);Trillium Ag开发了新型农业生物平台Agrisomes,能够通过对dsRNA进行修饰和组装,提高dsRNA的靶向性、特异性、递送效率及稳定性,进而克服农业生产中RNAi应用的很多关键障碍(http://www.trilliumag.com/)。这些公司研发的核酸包被平台,大大提高了dsRNA在环境中的稳定性,从而加快了RNA生物农药的商业化进程。


2.1.3  我国RNA生物农药应用研究现状


我国在RNA生物农药研发领域的起点比较高,最早在2007年,中国科学院上海生命科学研究院陈晓亚院士团队与孟山都公司同步作出了具有里程碑意义的研究成果,随后大量的研究团队在这一领域进行了各个层面的深入研究。如中国科学院分子植物科学卓越创新中心苗雪霞团队在多物种靶标基因库构建、制剂配方优化、规模化生产体系以及安全性评估等领域进行了大量的研究;中国科学院微生物研究所郭惠珊团队利用跨界RNAi技术,构建了棉花抗黄萎病体系;中国农业科学院植物保护研究所王桂荣团队针对棉花害虫绿盲蝽(Apolygus lucorum)构建了植物介导的RNAi转基因玉米与大豆系统;中国农业大学沈杰团队通过纳米包被技术显著提高了dsRNA的稳定性,进而提高昆虫RNAi效率;中山大学张文庆团队以及山西大学张建珍团队针对褐飞虱(Nilaparvata lugens)和飞蝗(Locusta migratoria)的靶标基因筛选均取得了较好的研究进展。但是,我国在成果转化、产业化及商业化程度上显著落后于国际水平。同时,由于国内大型农药企业的缺失,目前尚无成熟的RNA生物农药产品。截至2022年2月,我国基于RNAi技术的生物农药企业,仅有上海植生优谷生物技术有限公司在棉蚜(Aphis gossypii)、桃蚜(Myzus persicae)、黄曲条跳甲(Phyllotreta striolata)等害虫的田间测试均取得了较好的防治效果,同时,在dsRNA规模化生产方面取得了实质性的进展,计划于2023年提交农药登记申请;此外,以上海交通大学农业与生物学院首席研究员唐雪明为创始人的硅羿科技(上海)有限公司,于2021年通过全国农药标准化委员会审核,获得了3张RNA生物农药——″核酸干扰素″命名函。其主要为针对烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus,TMV)的核酸干扰素,目前已经进入田间测试阶段(https://www.zhongqiwang.cn/index.php?s=/qita/7016.html)。


2.2  RNA生物农药商品化进展


RNAi技术在农业病虫害防治中的应用方式主要有两种:一是通过转基因手段在植物中表达针对病虫害靶标基因的dsRNA,从而实现病虫害防控,是一种以转基因作物为主的植物源保护剂(plant incorporated protectant,PIP);二是直接将dsRNA制成喷剂,利用喷洒的方式进行害虫防治,即非植物源保护剂(non plant incorporated protectant,non-PIP)。


2.2.1  植物源保护剂形式的RNAi产品


针对植物源保护剂形式的产品,2017年,孟山都公司(现拜耳)新一代转基因玉米MON87411获得EPA批准,随后在多个国家获得种植许可,用于防治玉米根萤叶甲(Diabrotica virgifera)。该产品在玉米中同时表达了Bt蛋白(Cry3Bb1),耐除草剂基因cp4 epsps,以及针对玉米根萤叶甲Snf7的dssnf7,MON87411是国际上首例在植物中表达dsRNA的产品。2021年1月21日,拜耳宣布该产品获得中国农业农村部颁发的转基因生物安全证书(进口和食品/饲料用途),进一步加速了该产品的商业化进程。同时,拜耳预计该产品于2022年在美国进行商业化种植,2023年在加拿大进行推广,未来几年内,推广1,500万英亩(约600万公顷)。2021年2月9日,澳新食品标准局(FSANZ)批准基于RNAi的耐除草剂和抗虫玉米产品DP23211用于食品,该转基因玉米同时表达了dsDvSSJ1和IPD072Aa蛋白用于防治玉米根虫(Diabrotica spp.)(https://www.foodstandards.gov.au/code/applications/Pages/A1202.aspx)。


此外,还有多个基于RNAi技术的转基因植物获批,进行商业化种植。2014年,JRSimplot的InnateÔ(SPS-ØØE12-8(E12))马铃薯在美国获准种植,随后在马来西亚、加拿大、墨西哥、日本、澳大利亚和新西兰等多个国家获批。该种马铃薯携带4个RNAi基因,其中3个针对″改善″丙烯酰胺水平,第4个针对黑斑病毒控制基因(https://www.isaaa.org/gmapprovaldatabase/event/default.asp?EventID=381)。


2018年,拜耳(孟山都)转基因大豆(MON87705)商业化(https://www.isaaa.org/gmapprovaldatabase/event/default.asp?EventID=177)。该大豆能够通过特定基因修饰改善脂肪酸谱,而且该公司已申请该作物的国际出口。


我国在植物源保护剂形式的RNAi产品研发和应用方面也取得了较好的研究结果。中国科学院微生物研究所郭惠珊团队长期致力于应用RNAi技术进行棉花抗黄萎病的研究工作,2019年,该团队与新疆华晨合丰投资有限公司达成战略合作协议,该公司将在最短时间内资助课题组改善中试、生产性试验以及品种审定等环节,加速成果转化和产业化速度。


2.2.2  非植物源保护剂形式的RNA生物农药


2019年,拜耳向美国EPA提交了新产品BioDirect,该产品是利用RNAi原理,通过dsRNA进行蜜蜂狄斯瓦螨防治,这是向EPA提交的第一份外源应用的RNA生物农药活性成分。2021年5月,拜耳将该部分专利授权给Greenlight Biosciences进行dsRNA的生产,新产品预计2024年上市。另外,Greenlight Biosciences公司对外宣布,将在2022年向EPA提交注册一种用于防控马铃薯甲虫的dsRNA产品。同时,该公司也在积极研发针对白粉病以及灰霉病的RNAi产品,预计2025年能够作为第一款杀菌剂进行批准上市。


此外,还有多家公司布局直接喷洒型的RNAi产品。RNAissance Ag LLC在积极开发针对小菜蛾的喷雾式RNA生物农药;先正达公司在进行马铃薯甲虫RNAi杀虫剂的研制,并且预计在7~10年实现商业化。


从目前的研发状况来看,基于RNAi技术的抗病虫产品在未来几年具备上市的可能性。目前,我国尚无提交注册的RNAi农用相关产品。


03

国际上对RNA生物农药相关政策及解读


3.1  经济合作与开发组织(OECD)文件解读


目前为止,还没有任何一个外源施用的dsRNA杀虫剂被批准使用,然而,一旦有该类产品获准上市,会影响到整个农药行业的格局。因此,国际上相关领域的科学家及农药公司也在密切关注RNA生物农药的动向。


2019年4月10~12日,经济合作与开发组织(Organization for Economic Cooperation and Development,OECD)在巴黎组织会议讨论dsRNA作为外用植物保护剂的使用情况,该会议由来自学术界、工业界和政府的60余名成员参加,出席会议的国家包括澳大利亚、奥地利、比利时、加拿大、捷克共和国、丹麦、爱沙尼亚、法国、德国、匈牙利、荷兰、瑞士、英国和美国,此外,代表欧盟委员会的相关专家也出席了会议。会议就RNAi相关产品的研发,外部使用dsRNA的环境归属问题,以及在非目标生物(non-target organism,NTO)中的暴露情况进行了讨论与总结。2020年9月25日,OECD在Series on Pesticides No.104在线正式发表″关于喷洒或外部施用dsRNA杀虫剂的环境风险评估的考虑″,就OECD会议内容进行了总结。


会议就喷洒型RNA生物农药在农业中的应用进行讨论,主要包括RNA生物农药结构、特点、商品化类型;基于dsRNA的产品监管和政策;dsRNA在环境中的命运、对非靶标物种的影响、环境风险评估、对人类健康风险评估,并对一些目前尚不确定的因素进行了分析。主要内容可概括为如下几点:


(1)针对喷洒型RNA生物农药的研发和应用,制剂和配方至关重要。因为相比于传统化学农药,dsRNA在环境中更易于降解,合适的制剂和配方对于dsRNA的吸收和稳定性非常关键。此外,会议认为,现有的评价Bt转基因作物稳定性的标准可以作为dsRNA相关产品在进行环境归宿以及稳定性评估的参考。


(2)RNA产品的环境命运和对非靶标物种的影响至关重要。会议讨论了生物信息学在进行潜在风险评估中的应用,由于不同物种对于dsRNA的摄取方式不同,RNAi机制不同,因此利用生物信息学在进行脱靶效应的风险评估方面的价值是有限的,单独对于序列的生物信息学分析不能作为对非靶标物种影响的唯一预测指标,但是其在dsRNA产品的设计阶段以及对于非靶标物种进行研究时至关重要。


(3)RNA产品对人类健康及潜在影响问题。OECD会议认为,dsRNA作为核酸类物质,与人类及其他可能摄取的生物体中的基因序列组成相同。核酸是植物、动物性食品和饲料的天然成分,是人类和动物日常消耗品。同时,人类和其他脊椎动物中存在显著的生理和生化屏障,比如唾液及消化道中的核酸酶、胃液中的pH差异、细胞中的溶酶体等都影响外源dsRNA核酸的摄取。因此,dsRNA对于人类健康来说,是相对安全的。


(4)一些目前尚不确定的问题,也可能是影响RNA生物农药的重要因素。比如一些生物中含有RNAi的信号放大效应,这会影响到dsRNA环境暴露的评估;不同生物体中不同的RNAi通路相关机制,可能产生相应的脱靶效应;同时,如果随着dsRNA的大量使用,随之而来可能产生对RNA生物农药的抗性问题,也是需要考虑的。


此外,根据RNAi机制和作用原理,相比于传统的化学农药,以dsRNA为基础物质的生物农药可能需要更长时间的见效期,这也是在进行环境及毒理评估时应该考虑的问题。


OECD会议的召开,以及相关工作文件的发表,说明RNA生物农药已经逐渐被政府了解、重视,并对相关问题进行考虑。这也将进一步促进RNA生物农药研发、上市、推广、应用等各个环节。


3.2  欧美一些国家对于RNA生物农药的归类


基于RNAi技术的RNA生物农药具有众多的优势,相比于传统的化学杀虫剂,其具有更强的特异性,且容易在环境中降解,因此,是一种绿色无污染的生物农药。另外其研发较易,开发费用低,技术层面的问题较易解决,但在其商业化应用之前,仍需要经过不同国家相关部门的安全评估和授权程序。


3.2.1  美国对RNA生物农药的归类及安全性评价


针对植物中表达dsRNA的植物源保护剂,美国环境保护署(U.S. EPA)已经批准拜耳的转基因玉米MON87411,该转基因玉米同时表达Cry3Bb1、CP4EPSPS及dsDvSnf7。EPA针对MON87411中产生的成分dsDvSnf7作为生物化学物质进行了环境持久性研究,评估了其在陆地及水环境中的归宿,同时评估了针对非靶标生物鸟类、哺乳动物、淡水无脊椎动物、淡水鱼、海洋和河口鱼类及无脊椎动物,非靶标昆虫、蜜蜂及其他无脊椎动物的毒性及安全性。笔者注意到,在进行环境风险评估时,某些物种只用到了生物信息学分析的方法,并以分析结果作为环境评估的依据。比如,对鸟类的红隼、石鸽和绿头鸭,哺乳动物中的肉牛、家养狗、马、家鼠、挪威大鼠、猪,蜜蜂和大黄蜂基因组进行了生物信息学分析。dsDvSnf7对非靶标物种的影响主要是对广泛类群以及最有可能受到影响的物种的测试,主要评估了包括物种生存、生长、发育和繁殖在内的各项影响,并选择足够长的时间评估潜在的不良反应。同时,考虑到实验中dsRNA可能降解的问题,采取了足够高的浓度进行测定。EPA的结论显示,dsDvSnf7不太可能对非靶标物种具有生物学意义上的影响(https://www.epa.gov/sap/meeting-materialsjanuary-28-2014-scientific-advisory-panel,https://www.epa.gov/sap/meeting-materials-september-27-28-2016-scientific-advisory-panel)。值得注意的是,EPA对该产品进行风险评估过程中,大量的测试并不是通过转基因植物或者植物提取物,而是通过合成游离的dsDvSnf7进行的,这也为未来基于直接利用dsRNA生物农药的环境评估提供了一个参考。


针对直接使用的非植物源RNA生物农药,目前尚未有产品获得EPA批准。在美国,针对各类型的此种产品,主要由《联邦杀虫剂、杀菌剂和灭鼠剂法》(FIFRA)和《联邦食品、药品和化妆品法》(FFDCA)进行农药的规范和管理,并授权EPA对农药进行登记与评估。所有的杀虫产品需要经过EPA注册、登记,才能进行后续的生产、运输和销售。田间测试也需要经过实验使用许可,EPA评估农药最终使用产品的注册,并对活性成分和实际产品进行评估。美国多数州参考EPA的审查数据和结论,但是也有少数几个州需要向其提交数据,进行随后的评估。


针对喷洒型的dsRNA产品,由于目前尚未有产品被批准上市,因此,并没有关于喷洒型dsRNA类农药的明确归类问题。但是,基于上述美国对植物源RNA生物农药的检测和管理可以看出,美国EPA更倾向于将其作为生化杀虫剂进行相关的要求,关于这一点,可以参照EPA颁布的″联邦法规第40篇(CFR)第158部分″,以及″Subpart U-Biochemical Pesticides of 40 CFR Part 158″的数据要求,对农药活性成分和产品进行评估。


3.2.2  欧盟及其他国家对RNA生物农药的归类及相关政策


在欧盟,任何植物保护产品(plant protection products,PPP)(农药),均需要对其活性物质和最终产品进行授权,其中活性物质的授权是植物保护产品(农药)授权的先决条件。欧盟委员会(European Commission)依托欧洲食品安全局(European Food Safety Authority,EFSA)对活性物质进行风险评估与指导。此外,OECD、欧洲和地中海地区植物保护组织(European and Mediterranean Plant Protection Organization,EPPO)和EFSA编制的指导文件对这些法规进行了补充,描述了活性物质和农药产品风险评估的方法学要求。


在欧盟,主要将PPP分为化学品、微生物以及基础物质,并没有美国以及中国农药分类体系中生物农药这个类别,由于dsRNA的PPP并不属于微生物以及基础物质范畴,目前还没有任何具体的指导文件定义基于dsRNA的PPP授权,但是OECD(2020)给出了一定的指导意见。目前基于dsRNA的PPP在欧盟仍被视为化学PPP,但也有可能会根据具体情况决定对特定关注领域的风险评估进行豁免或者调整。


尽管目前还没有针对dsRNA产品的法规政策,但在欧盟,以dsRNA作为活性物质的PPP应用预计在未来几年内实现。因此,欧盟主管当局应开始深入讨论未来如何充分评估此类产品的风险。目前,EFSA将RNA生物农药风险评估定义为安全,因为喷洒的dsRNA对动物、人类造成的风险很低。具有决定性的论点认为,由于喷洒dsRNA需要克服较多的生物和物理屏障,因此,口服RNAi产品对于干扰人类基因表达的概率很低,造成风险的可能也很小。


2018年5月,新西兰环境保护局决策委员会(the Decision-Making Committee of the New Zeal and Environmental Protection Authority)发布了一份公告,结论是用dsRNA处理(包括摄取、吸入和吸收)的真核细胞或者生物体不属于新的生物。因为通过dsRNA处理真核生物,并不能修饰及改变其染色体DNA,也不能产生可遗传的变异,不属于新的生物体,因此,无需进行风险评估。同时,新西兰初级产业部(the Ministry of Primary Industries)将RNA列入″可忽略不计的风险登记册″。因此,在新西兰,任何人都可以在开放环境中使用任何dsRNA材料处理真核生物(尚未被列为生物安全威胁),而无需任何事先批准。


04

RNA生物农药亟需解决的问题


4.1  RNA生物农药技术层面需要解决的问题


依据目前的研发进度,RNA生物农药极有可能在未来几年上市。目前来看,RNA生物农药在技术层面上还有一些问题需要解决。


4.1.1  高效RNAi靶标基因的筛选


RNA生物农药优势之一是利用低剂量dsRNA即能够引起高效RNAi效应,因此,获得目标生物高效致死的RNAi靶标基因是研制RNA生物农药的关键。目前对于靶标基因的筛选和获得,可以通过以下几种方式:(1)已知的病虫生长发育过程中的关键基因,作为可能的靶标基因进行筛选;(2)通过相近物种中已知的高效靶标基因的同源序列基因进行筛选;(3)通过测序技术,对病虫不同组织、不同发育阶段基因进行研究和筛选,从而获得高效致死作用的靶标基因。通过这些方式,已经获得多个重要害虫的靶标基因。但是,在筛选靶标基因的同时,也发现不同种类昆虫RNAi效率不同。比如,相比于鞘翅目、直翅目昆虫,鳞翅目昆虫RNAi效率较低,高效致死作用的靶标基因筛选也相对困难。这可能是由于昆虫自身特异基因、中肠环境、RNAi通路机制存在差异所导致。在针对此类昆虫筛选靶标基因时,就需要综合考虑。由于同一靶标基因在不同物种中行使的功能并不完全一致、不同作用机制的靶标基因抗性程度可能存在差异、不同物种中RNAi作用机制存在差异,而这些都是影响靶标基因作用效果的重要因素,因此,在选择靶标基因的过程中均需考虑。


4.1.2  dsRNA的生产成本


dsRNA合成成本是RNA生物农药能否在田间施用的至关重要的因素。合成dsRNA主要包括化学合成、体外合成以及微生物发酵合成3种方式。化学合成成本高,并且随着dsRNA合成长度的增加,合成错误率增加,一般仅适用于实验室研究的小剂量使用,而不适合大规模生产;体外无细胞系统的合成方式主要通过表达dsRNA的元件,之后通过对合成体系进行调整优化,进行体外合成并纯化。目前,基于此种合成方法,美国Greenlight Biosciences公司研发了无细胞合成体系,能够将dsRNA的合成成本控制在1美元/g以内,其成本已经能够满足田间规模化应用的要求;利用微生物发酵表达合成dsRNA也是目前可能规模化应用的方式之一,已在包括大肠杆菌(Escherichia coli)、酿酒酵母、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)等多种底盘细胞中构建并得到合成dsRNA的菌株,通过提取微生物发酵产物或者将微生物灭活后处理相关的靶标生物,均能够产生相应的RNAi表型。例如加拿大Renaissance BioScience公司通过专属的酵母载体表达dsRNA,饲喂马铃薯甲虫,能够精准地抑制靶标基因的表达,并且对马铃薯甲虫致死率高达98.3%,达到保护植株的功效。


4.1.3  dsRNA的稳定性


dsRNA属于核酸类物质,在复杂的大田环境(pH、光照、雨水、微生物等)中或者存在核酸酶的情况下,极其容易发生降解。因此,RNA生物农药的稳定性及货架期对于此类产品的开发至关重要。目前,已经有多种手段提高dsRNA的稳定性。例如,通过纳米包被,显著提高dsRNA的稳定性;通过BioClay的包被,能够显著提高dsRNA在叶片上的存在时长,增加喷洒型dsRNA的作用效率。同时,也有多家公司专门开展针对dsRNA稳定性的各种助剂以及纳米颗粒的研发,结果显示,添加各种辅助产品可显著增加dsRNA在环境及靶标生物体内的稳定性。


4.1.4  其他问题


除上述几个主要问题外,RNA生物农药的递送效率、RNA生物农药在进行环境风险评估时残留量的检测等均为该类农药应用之前亟需解决的关键问题。随着科研机构、相关企业以及投资机构对该领域的进一步深耕,相信这些问题能够迎刃而解,从而推动RNA生物农药的早日推广使用。


4.2  RNA生物农药的环境评估及政策层面需要解决的问题


RNA生物农药能否早日实现商业化应用,除了技术层面的问题之外,还面临着可能的环境及政策层面需要解决的问题。


RNA生物农药在获得农药许可证书之前,需要进行环境风险评估。主要包括评估应用过程中释放的dsRNA在环境中的存在及降解情况,对非靶标物种的影响,以及对人类健康存在的可能风险。对于dsRNA含量,目前在实验室条件下主要采用分光光度计、琼脂糖凝胶电泳及PCR进行检测,需要相对专业的实验室环境。由于不同检测方法的灵敏度存在差异,因此需要研发针对环境中痕量dsRNA的简便、快速、高灵敏度检测方法。目前,通过放射性同位素32P标记的方法,可以显著提高环境中dsRNA的检测灵敏度。在对非靶标物种的影响方面,除了采用传统的急性及慢性毒理检测手段之外,根据RNAi的作用机制(dsRNA仅对能够良好匹配的目标mRNA产生抑制作用),能否利用生物信息学手段对非靶标物种的整个基因组序列进行分析,预测目标dsRNA对于非靶标物种的可能影响?这种检测方法的可信度以及能否作为一种技术手段或参考应用于RNA生物农药的环境毒理检测,也是需要深入探讨的重要问题。


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总结与展望


RNA生物农药具有众多优势:(1)利用RNAi技术可以针对某种病害或虫害设计物种专一性RNA生物农药,同时不影响非靶标生物;(2)可以利用物种间的共有靶标设计出针对多个物种的种间广谱性RNA生物农药;(3)以dsRNA为主体形式的制剂在环境中能够快速降解,在保证防治效率的前提下,残留和环境污染问题几乎可以忽略;(4)该技术只是暂时关闭害虫某个基因的表达,没有改变生物体自身的基因组,不会产生可遗传的变异,因此几乎不影响生态系统;(5)靶标基因的可替代性较高,不容易产生抗药性;(6)RNA生物农药产品制剂具有纯度高、起效快、无毒、无污染、防控范围广、价格低廉等化学农药和常规微生物农药所无法比拟的优点,在市场竞争中拥有比较明显的优势。


当前RNA生物农药在全世界范围内发展迅猛,已有两例基于转基因的产品(MON87411和DP23211)批准上市,基于直接喷洒型的RNA生物农药,尽管没有相应的产品,但是,国际上多家农化巨头公司均有相关产品的大规模布局,预期近几年会有相关的产品上市,而我国在此领域尚处于起步阶段。RNA生物农药作为农药史上革命性产品,将是我国在农药领域实现弯道超车的一次重要机遇。同时,RNA生物农药如何使用,环境释放风险评估等均是至关重要的问题,需要进行充分的调研和商讨。并且,针对直接喷洒型的RNA生物农药,目前可以通过微生物发酵获得,也可以通过体外直接合成dsRNA产品,那么,对于两种来源的dsRNA,能否归于同一个类型,需要管理机构充分考虑并进行规范管理。目前,影响我国RNA生物农药产业化的瓶颈有两个:一是dsRNA的低成本规模化生产;二是相关政策的制订及应用许可。因此,加速推进我国在RNA生物农药领域的深度布局,快速形成一批具有核心知识产权的新兴农药公司,有助于树立我国在该领域的国际地位。目前,我国已经将RNA生物农药作为优先发展领域,这说明,政府部门也已经注意到RNA农药的发展前景,并对此进行了相应的规划,这无疑对于RNA生物农药的发展是利好消息。当然,快速推动RNA生物农药的发展与问世,还需要政府部门充分考虑我国的现状,并积极制定相关的政策法规,同时,也需要国内传统的农药生产企业具有前瞻性视野,进行长期布局,并吸引民间资本进行规模化的研发和产业结构调整,以快速推动RNA生物农药的应用和商品化。

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