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腐植酸检测方法的前世今生 qrcode

2021-11-19

世界农化网中文网报道: 


随着生物刺激素市场的进一步繁荣,腐植酸作为其中重要的一环越来越受人关注,而产品检测报告是大家评价质量好坏的重要标准(注:产品含量不代表产品质量),而市面上存在的不同检测标准和方法,导致大家对产品真实的腐植酸含量充满疑惑。国际上由于检测技术发展和研究的深入,出现了新的方法逐步统一的过程,但仍然存在一些国家采取其他方法的现象,导致了注册流程上无法统一,给众多厂商带来困扰。田本农化20多年来见证了不同国家腐植酸检测方法的变化,也参与到了一些检测方法的研究和制定,正好利用此机会将腐植酸的检测方法做一个梳理,希望解答大家的一些疑惑。


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田本农化在实验室向客户演示腐植酸的检测方法



一、腐植酸的研究历史


当1786年,德国化学家和生物学家Franz Karl Achard 一次从德国的泥炭沼泽中提取腐植酸以来,人们关于腐植酸的来源、检测的争论就一直未停歇,我们尝试着回溯这个历史,并探讨一下检测最新的发展。


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1786年首次报道提取腐植酸,Achard手稿


一直以来人们认为腐植酸来源是土壤,而Achard用碱从土壤中提取腐植酸的办法是首选方法。而1819年Braconnot,将酸添加到淀粉和蔗糖中,形成了一种黑色沉淀物,看起来像是土壤中提取的腐植酸,人们把这个称作“人工乌敏素”“artificial ulmin”。从此人们讨论腐植酸来源是多糖,20年后Mulder将纤维素合成了腐植酸,人们进一步确定了腐植酸来源是多糖。尽管对于腐植酸的来源已经明确,但是关于腐植酸分类的争论仍在进行,由于腐植酸似乎可以无处不在,可以用不同溶剂以不同的比例提取,同时用不同的方法在各种来源提取到。因此提取物有不同的溶解度、颜色、质地,导致了各种新的命名产生,是人们花大量的精力在分类而不是特性的研究。


1870年有两项发现开始让人们重新讨论腐植酸的来源,首先是其他结构简单的有机化合物如四氯化碳可以产生看起来像天然腐植酸的深色物质,而糖类和这些化学物质显然都不能成为腐植酸的前提,人们开始怀疑多糖来源的说法。其次是腐植酸的化学式和组成的研究表明其包含了复杂的成分,除了碳、氢和氧,还有氮、醚、羟基、烷基和呋喃等。从此多糖来源学说开始失宠。与此同时微生物作为新兴研究领域被引入腐植酸的研究,人们开始认为腐植酸来源于微生物对木质素的分解而成,尽管中间还有各种研究反对这种说法,直到1938年作为微生物学家的Waksman写了一本名为“Humus”的畅销书,他强烈支持腐植酸的形成是木质素的微生物起到了作用,从此木质素来源学说开始占据了主流。


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Waksman关于腐植酸的畅销书《 HUMUS》


木质素来源有产生了新的争论,腐植酸是芳香族还是脂肪族。因为人们一开始只在腐植酸中发现了芳香族化合物,直到1957年Shapiro再次尝试用化学式定义腐植酸(现在来看,这个不太现实),他创造性的引入了色谱,有机溶剂萃取,液相IR等手段来分析腐植酸,他的研究表明腐植酸,至少乙酸乙酯可溶的部分式脂肪族的。然而1966 年 ,Kononova 出版了一本关于腐殖酸的流行书,与之前 Waksman 的书一样,强烈支持木质素起源理论。随着新的研究技术如KBR颗粒法,分光光度法,以及固体核磁共振的出现,越来越多的实验表明腐植酸是脂肪族化合物,同时随着Anderson和Russell合成脂肪族腐植酸,Nissenbaum和kaplan发现了来自于海洋的腐植酸,腐植酸脂肪族结构的学说也开始为人们接受。


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海洋中的发现腐植酸


1982年支持木质素的起源的团体建立了国际腐殖质协会(IHSS)通过收集标准腐植酸样品来帮助研究人员消除数据的不确定性。而另一方开始支持腐植酸脂肪族结构的理论。伴随着技术进步和大规模商业化,从此腐植酸的研究开始进入现代化。当然关于腐植酸来源的研究还在继续。



二、腐植酸的检测方法演进


最开始人们关心的土壤的有机质,直接用土壤重量减去灰分和水分得出有机质含量。19世纪40年代分光光度的方法开始流行,常用的方法是将腐植酸样品暴露在光下;将吸收的光量与取自德国矿山的 Sigma-Aldrich 标准化样品的定量值进行比较。但由于历史标准物和现在不同,同时不同的样品内的分子内电荷转移相互作用是的分析结果差别很大,逐步被人们放弃。


19世纪60年代开始流行尺寸排除色谱法,一种尺寸排阻凝胶在柱中分离不同分子量大小分子的方法,但由于腐植酸样品的来源不同,同时腐植酸盐列聚合物不适合在动态平衡中分离,导致方法色谱高度不一致,结果不准确。


另一种影响很大的方法是CDFA法(又称加利福尼亚方法),该测试由加利福尼亚州农业部开发。它分离了腐植酸和黄腐酸后,撇去黄腐酸,仅测量剩余的液体,还包括有机灰分含量,因为没有排除灰分的影响导致很多灰分多的产品最终腐植酸含量很高,同时由于加利福尼亚州不承认黄腐酸,导致含有黄腐酸的样品在标签上不得不标注较低的腐植酸含量。


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现在国际范围内应用最广泛的方法是氧化法(重铬酸钾)和ISO的方法


重铬酸钾氧化法利用测定氧化过程中消耗的氧含量和碳含量的对比,从而计算出总腐植酸的含量,同时可以用pH=1来沉淀出黄腐酸,来测定黄腐酸的含量。须注意的是样品的开始称取量和步骤会导致有些许差距。另外,在不同国家采用的碳系数不一样,会导致最终结果有一定的差别。


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此为田本农化现在用的检测方法


2014年Richard T. Lamar发表了一种新的关于腐植酸的检测方法,随着IHSS和HPTA(腐植酸产品贸易协会)的推动,此方法为CDFA接受,并成为ISO的标准检测方法。


此方法通过严格步骤将腐植酸沉淀分离称取重量,同时创造性的利用了DAX-8树脂对疏水性黄腐酸吸取的特性,准确的测量了疏水性黄腐酸的含量。


不过值得注意的是,传统定义中多糖,氨基糖,氨基酸类作为亲水性的黄腐酸测量不出来。同时,由于木质素磺酸产品会破坏DAX-8树脂,因此在检测之前先要通过傅里叶变换红外光谱法区分木质素黄腐酸


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此为ISO的标准检测方法


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此为两种方法的检测结果对比图:上图为田本腐植酸钾产品用重铬酸钾氧化法检测产品,下图为田本腐植酸钾产品用 ISO方法检测,其中黄腐酸含量差10%以上


三、未来展望


随着技术的发展和行业组织的推动,氧化法和ISO方法逐步成为主流方法,并且越来越多国家采取ISO的检测方法。但是ISO方法由于耗时长,检测成本高,目前在中国实验室暂未得到推广。


回顾历史我们发现随着人们对腐植酸的研究深入和检测技术的提升,我们能够更加准确的了解腐植酸。这个过程中少不了无数研究人员的推动和企业的努力,依稀记得多年前我们与沙特客户一起去沙特农业部解释重铬酸钾氧化法的优势的下午,阳光灿烂。


沙特客户1.jpg


更多了解腐植酸产品和检测方法,请联系:

童雷霆

TBIO田本农化国际原料部总监

queen@tbio.cn

13474021340



参考资料:

1.https://humicacid.wordpress.com/a-history-of-humic-acid-research/

2. Kononova, M.M. Soil Organic Matter, 2nd Eng. ed., Trans. Nowakowski, T.Z. and Newman, A.C.D. (Pergamon, Oxford, UK, 1966).

3.https://humic-substances.org/

4.https://www.humictrade.org/about-hpta/

5.https://www.minerallogic.com/testing-method

6.https://www.cdfa.ca.gov/is/ffldrs/pdfs/HumicAcid.pdf

7.https://www.researchgate.net/publication/315822454_Humic_Acid_Determination_in_some_Compost_and_Fertilizer_Samples

8.https://www.tandfonline.com/doi/abs/10.1080/03650340.2019.1575511?journalCode=gags20

9.https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/25051616/

10.https://www.iso.org/obp/ui/#iso:std:iso:19822:ed-1:v1:en


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