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基因驱动系统能否在农业杂草管理中发挥作用?

来自分类:行业观点
2019-05-20
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 作者:张翼翾 上海市农药研究所
 
自20 世纪40 年代开始人们逐渐认识到人类介导的基因干预能够压制和防治对农业和人类健康有不利影响的害虫。在最近5 年中,随着研究开发基因编辑技术CRISPR-Cas9 的热情不断高涨,认识到采用此技术在野生种群中扩散精确编辑基因的潜力。虽然基因驱动系统具有逆转除草剂抗性问题的可能,但到目前为止,没有应用基因驱动系统管理杂草的潜力和局限性的综述。本文简要地介绍了害虫遗传防治技术的发展,农业杂草管理对新颖遗传防治策略的需求,基因驱动的应用潜力、可行性和局限性,并提出建模研究⑴ 这些方法的实用性;⑵ 杂草管理的基因驱动系统的未来设计和应用。
 
1 在害物管理中遗传防治的作用
 
在农业和卫生保健中,害物(食草和传播疾病昆虫、病原菌和杂草)的防治主要依靠合成农药。农药防治已取得显著的成功,大幅减少了作物产量的损失,防治了传播人类疾病的昆虫媒介而挽救生命。然而,农药使用导致全球农药抗性的广泛发展,对非靶标环境和人类健康造成的影响不断受到关注,急需新颖、可替代防治策略。各种物理、农艺、生物和农业-生态方法可用于害物防治和种群压制,而遗传防治策略能够直接操纵害物的基因组,降低害物的适合度,也引起人们的关注。
 
1.1 农业害物的间接遗传防治
 
通过选择优良的作物栽培品种、育种或基因工程(或编辑)改良的作物种子而对农业害物进行间接的遗传防治。许多作物品种和其野生近缘种发生遗传变异而对害虫和病原菌具有耐受性。作物品种也可能在与杂草的竞争和化感作用中发生变化。当繁育的作物品种对害虫和病原菌具有耐受性状时,且这些形状对作物农艺形状和营养没有不利影响的话,可通过标记辅助育种将这些性状再引入。
 
最近几十年中最具革命性的农业技术之一是开发和商业化了表达除草剂抗性和害虫抗性性状的转基因作物。转基因抗除草剂作物实现了在作物田中使用广谱、非选择性除草剂进行杂草防治,是革命性杂草管理策略。转基因抗虫作物能产生防治害虫的杀虫蛋白,故不需要使用杀虫剂或减少了杀虫剂的使用。虽然害物仍易于发展抗性,而且在转基因抗除草剂作物田中仍需要使用除草剂防除杂草,但这些技术表明源于分子生物学的害物防治策略在不断发展。
 
到目前为止,已开发了直接遗传防治害虫的数种潜在方法(在1.2 节中进行介绍)。然而,虽然这些方法已取得一些成功,但总的来说,在广泛分散的天然种群中扩散降低个体和种群适合度的工程基因有很大的难度。
 
1.2 直接遗传防治害虫策略的发展
 
有2 种直接遗传防治害虫的方法:自我限制机制(self-limiting mechanisms)和自我维持方法(self-sustainingapproaches)。自我限制机制是淹没式引入基因修饰昆虫,与靶标昆虫种群交配,通过致死性交配压制害虫种群。自我维持方法是指驱动种群基因改变。通常,这些“驱动”基因改变降低了害物适合度,增加多代、非孟德尔遗传频率,导致种群被取代。已提出许多方法限制自我维持驱动的时空扩散。
 
1.1.1 自我限制机制
 
防治昆虫的自我限制遗传机制要先大量饲养昆虫,然后释放到自然种群中进行不育交配。这些方法是致死性的,不能持续发挥作用,不能在种群中扩散,对种群的压制程度取决于释放昆虫和野生昆虫种群间交配的比例。开发和应用的第一个昆虫遗传防治系统为“不育昆虫技术”。此方法为首先大量饲养昆虫,然后辐射处理使它们不育;在一个区域大量释放不育昆虫(主要为雄性),不育雄虫与野生雌虫交配,雌虫产生的卵不能存活,害虫种群数量下降。此技术已用于防治数种害虫,取得了显著的成功,但不育昆虫技术以相对小的害虫种群为靶标,需要大量释放辐射处理的昆虫,其发展可能会受到辐射处理雄虫适合度降低的限制,故不会被广泛应用。最近,已开发了携带显性致死基因(RIDL)的昆虫释放技术。此方法利用转基因技术在大量饲养的昆虫的基因组中引入了致死突变,无需辐射处理。雌性特异性RIDL 系统通过性别特异性选择性剪接方式产生四环素阻遏反式激活融合蛋白(tetracyclinerepressibletransactivation fusion protein),使雌性昆虫死亡。此系统独特的特性是在饲养时饲料中添加四环素,昆虫正常生长,能大量饲养携带致死突变的昆虫;把携带致死基因的雄虫释放到野生种群中,和野生雌性昆虫交配,会产下完全可育的卵,但其中的雌性后代会在幼虫时期死亡,只有雄性后代能存活而继续发挥作用。
 
第三种自我限制昆虫种群压制方法被称为“昆虫不相容技术”。此方法的精确机制未知。在自然界,蚊等昆虫感染Wolbachia 后,与其形成稳定的共生关系,并能将这种共生菌传递给后代,其中感染该菌的雄蚊与自然界未感染Wolbachia 的雌蚊交配,产的卵不能正常发育,这种现象称为胞质不相容性。利用此规律用Wolbachia 侵染蚊,把感染Wolbachia的雄蚊释放到自然环境中与未被侵染的雌虫交配,来防治蚊,预防蚊媒传播疾病。这种既不需辐射处理也不是通过转基因方法获得的可大量释放的被侵染雄虫可作为替代性防治策略。当Wolbachia 被用于自我限制种群防治时,释放仅被侵染的雄虫非常重要,因为被侵染雌雄虫交配产生的卵可以正常发育。在一些笼式试验和小规模田间试验中,研究了昆虫不相容技术控制疾病传播介质库蚊和伊蚊的效果。
 
1.1.2 自我维持机制
 
设计自我维持、直接操纵害物基因组的基本挑战为适合度降低的基因在广泛分散的野生种群中扩散。根据孟德尔遗传定律,这些新颖等位基因因适合度低其在种群中扩散会受限制,在一定时期内低频率维持,最终在种群中消失。然而,违背孟德尔遗传“规则”的一些遗传机制的发现使修饰基因在害物基因组中有可能扩散。
 
“基因”或“减数分裂”驱动的天然进化机制已被广泛地介绍过。最早被公认的基因驱动系统之一是Wolbachia 侵染在种群中扩散细胞质不相容等显性基因。在Wolbachia 侵染的雄虫存在的情况下,未被侵染雌虫与其交配产生不育后代,因此被侵染雌虫的适合度大。增加可繁殖后代中Wolbachia 的频率,有效驱动种群中Wolbachia 的扩散,会导致交配成功率大大下降。
 
在减数分裂过程中破坏X 染色体,Y 驱动系统也可能使昆虫种群的性别比率偏离正常。对于埃及伊蚊,与Y 染色体有关的分离变相因子在天然种群中被80%~90%遗传给后代。可移动转座原件是在害物基因组中引入和扩散新颖基因序列的另一方式。如果能通过昆虫基因工程技术把适合度降低的基因嵌入转座子,那么此基因就能够在害物种群中扩散。甲壳虫、真菌和植物天然进化有另一自私遗传原件Medea 基因。Medea 系统能引起携带Medea 原件个体和敏感个体之间交配产生的所有卵死亡,除了固有Medea 原件的个体。
 
多样性基因驱动系统的存在有希望被实际应用,模型研究表明这些方法有潜力成功压制害物种群和限制昆虫媒介疾病的传播。然而,还缺少田间应用,这可能是因为要扩散严重影响害物种群适合度的基因比较困难。到目前为止,昆虫不育技术、RIDl 和基于Wolbachia 方法是仅有的实际用于害物管理的遗传防治策略。
 
有人提出应用归巢内切酶基因(homing endonucleasegene)进行遗传防治野生害虫种群是可能的,此提议使人们对基因驱动系统的应用产生很大兴趣。理论上讲,如果使用转基因方法把归巢内切酶基因插入功能基因中,会导致功能基因功能的损失。最初,功能降低的个体为杂合体。然而,在这些归巢基因存在的杂合细胞中,酶会切除确定位置的纯合染色体,插入自身的拷贝体,使杂合体转为纯合体。这些自私基因存在于多种微生物体中,通常位于基因内区,因此常对基因功能没有影响。这些基因驱动具有固有的归巢、切开和拷贝机器,使编辑基因或转基因在野生品种的基因组中扩散在理论上有可能,甚至在所致的基因改变降低了被处理个体和种群的适合度情况下。
 
2 CRISPR-CAS9 基因驱动系统的开发
 
细菌衍生的CRISPR-Cas9 系统的发现和随后的研究表明其能被用于真核细胞中精确编辑基因,这进一步说明开发野生害物种群的基因驱动技术具有远大的前景。此系统的优势为Cas9 核酸酶可被用于剪切基因组的任一部分,在导向RNA 协助下直接作用于靶标序列。应用此技术进行基因组编辑中,用同源重组途径在剪切位点拷贝基因驱动序列来修复剪切位点。基因驱动元件由导向RNA、Cas9 核酸酶和编辑修复模板组成,编辑修复模板可以在剪切点合并入新功能基因,或在剪切基因中引入精确序列变化。在自我维持基因驱动系统中,Cas9、导向RNA的序列和任何编辑或新颖的基因序列被插入剪切位置的基因组中。在二倍体生物中CRISPR-Cas9 被自动引导来剪切纯合染色体的相同点,通过同源重组插入结构。因此被修饰生物变为CRISPR-Cas9 和被编辑基因的纯合子,这表明所有的配子将传递此结构。编辑的纯合子和野生型个体间的交配将产生异性结合体,和前面一样Cas9 将被导向来剪切同源染色体,插入编辑基因,产生诱变链反应。最近人们开始关注自我维持基因驱动潜在的无限扩散时,拆分驱动系统(split-drive system)已被提出,此系统取决于第二基因的存在,此第二基因被正常遗传,能限制基因驱动的时空扩散。
 
2.1 CRISPR-Cas9 基因驱动的分子、生态和进化限制

此文章的第二部分介绍基于CRISOPR-Cas9 的基因驱动系统用于杂草管理的潜力。在研究此问题时,有必要考虑能使基因驱动用于杂草管理以及限制其成功的分子、生态和进化因子。本文简要地介绍了这些因素,因为它们与基因驱动的可行性、效果与扩散率(时间和空间上)和进化稳定性有关。在下文特别参考杂草植物的生物学来分析这些因素。

第一限制因素为与CRISPR-Cas9 基因编辑相容的靶标生物的遗传转化系统的构建。这不成问题时,种群水平基因驱动的分子遗传潜力将取决于与归巢效率有关的数个因素。Cas9 核酸酶必须确实剪切靶标序列的基因组;成功地对多种害物进行Cas9 基因组编辑表明这不会是一大限制。剪切特异性对精确基因编辑或敲除重要;而在大的基因组中可能存在大量相似的、脱靶序列,故较难达到。成功拷贝和扩散基因组的关键是,确保剪切序列通过同源重组而不是经非同源末端连接途径修复。同源与非同源DNA 修复途径的相对比率在不同生物体间和不同组织间可能不同,同源修复率会对基因驱动元件的扩散形成固有的限制。在设计不同昆虫品种的核酸内切酶基因驱动研究中,对于蚊子大于97%的剪切被成功地拷贝,而对于果蝇只取得不到78%的成功。确保对杂草的高比率同源DNA 修复是潜在应用基因驱动系统的必要第一步。
 
即使高比率地把杂合个体转换为纯合体,基因驱动仍需要多代来在种群中扩散。基因驱动扩散比率取决于种群的大小和生活史参数。例如在以下情况基因驱动扩散迅速:⑴ 相对靶标种群的大小,引入了大量的个体;⑵ 与驱动有关适合度代价值低;⑶ 一代时间短;⑷ 靶标品种异型杂交;⑸ 花粉扩散和种子移动介导的基因流动率高。
 
和显著降低害物适合度的所有防治策略一样,基因驱动也必进化,靶标种群的适合度恢复,种群能存活。基因驱动的抗性进化也可能发生,这是因为进行编辑点的识别、剪切和拷贝的分子机器不能正常发挥作用或选择基因组其他部位的等位基因,通过补偿进化使适合度恢复。
 
3 应用CRISPR-Cas9 基因驱动防治杂草
 
基于CRISPR-Cas9 的杂草种群压制的前提是基因驱动能被用于引入和扩散适合度负荷(fitnessload),适合度负荷能够限制杂草种群的建立、丰度、分散、持续性和影响(图1)。
 
这可能通过以与竞争、种子休眠、持续性、物候节律和形态学有关的杂草性状为靶标的基因操纵来获得,虽然目前这些方法潜力有限,因为不完全了解杂草性状的分子遗传基础。尽管如此,在小麦育种中已利用的Rht-1 矮化病基因的同源染色体可在相关禾本科杂草中确定。如果这些基因能够在种群中扩散,就可降低杂草的竞争能力。相似地,对杂草型水稻的研究已阐明有助于野生水稻持续性和扩散的进化的种子休眠和落粒性性状的遗传基础,此为降低农业生态系统中杂草适合度的另一分子靶标。也研究了使苋属等雌雄异体杂草品种性比率偏离正常的减数分裂驱动系统。对植物繁殖的研究集中于基因操纵,例如干扰配子的形成,限制授粉或卵细胞的产生,导致产生的配子数量减少。新兴的杂草基因组学领域已认识到了解杂草性状如何进化和其如何作为改良作物的遗传变异的潜在新颖来源的分子遗传基础的研究价值。鉴于直接遗传防治杂草的潜力,如果基因驱动系统能被用于敲除或修饰野生种群杂草性状,这些努力就会取得更大的成果。

虽然引入的压制种群的基因驱动的扩散可能受到地理或生物限制,但理论上,如果不加约束地扩散,可能会导致害物的灭绝。由于人们对种群压制驱动的伦理、监管和生物学关注,数人已提出保护此技术限制其时空扩散的措施。其中敏化驱动为增加靶标种群敏感度,随后进行管理或环境干预,此技术有可能通过监管批准和随后用于杂草防除。

敏化驱动具有较多优势:压制种群不取决于驱动元件,而是随后的管理,可在时间和空间上控制其应用。敏化驱动可被设计为扩散对生物适合度没有固有负面影响的工程化基因,有助于此基因的扩散,但更重要的是确保在特异性管理干预条件下进行种群压制。在杂草管理方面敏化驱动最主要的应用为把抗除草剂种群转为除草剂敏感种群。因为大多数除草剂靶标广为人知,许多抗性突变已被研究清楚,因此这在技术上可行(虽然需要开发杂草的转化系统和面对用CRISPR-Cas9 系统对这些品种的基因组进行编辑的技术挑战)。在杂草种群中扩散敏感性使杂草的敏感性达到能有效防治的程度,这需要数代,在此期间靶标除草剂不能被使用因为此除草剂会杀死携带使杂草敏感性恢复的元件的植物。即使在成功驱动后种群中仍有低频抗性个体,这可能导致对推荐使用的除草剂会快速发展抗性。随后必须对新的敏感种群进行抗性管理。也应该认识到随着此方法的应用会逐渐发现还没有完全弄明白的基因测定和遗传结构的复杂的、多基因机制除草剂抗性广泛扩展。
 
敏化驱动也可能用于在高度保守的重要植物基因中引入变化,引入基因赋予植物对特定设计除草剂分子敏感。编辑基因会不得不保持其正常酶活性来在种群中有效扩散,但这些方法能够为限制对环境和非靶标影响的高度靶标的化学干预物的设计铺平道路。
注:在引入和野生型个体交配后,在细胞水平植物基因驱动系统以下过程作用:(a) RNA 导向直接指引Cas9 核酸酶在野生型染色体的识别位点剪切DNA;(b) 以驱动染色体为模板通过同源重组修复剪切,使个体转化为纯合状态;(c) 在种群水平,具有工程化驱动的个体被引入野生种群;(d) 随着时间发展而扩散;(e,f) 直到携带驱动等位基因的个体在种群中占优势

图1 农业杂草的CRISPR-Cas9

基因驱动系统敏化驱动的其他有趣的可能是可想而知的。最近,以成熟杂草种子为靶标和破坏此种子,限制种子库补充的杂草防除技术已被开发。这些技术截留作物收获时成熟杂草种子,收集、去除或破坏这些杂草种子。对于一些杂草品种,例如西北欧的主要一年生禾本科杂草大穗看麦娘(Alopecurus myosuroides)的种子在作物收获前就成熟掉落,限制了这些技术的应用潜力。以种子掉落为靶标的基因驱动能使种子滞留于植物上直到作物收获期,此基因驱动技术可与收获期杂草防除技术合用来防除难防杂草。从概念上讲此方法可行,因为在水稻驯化期,靶标基因中的单核苷酸多态性负责植物落粒表型的损失。

4 杂草基因驱动:是否可从理论变为现实

本文想弄明白一个问题“基因驱动系统在农业杂草管理中有一席之地吗”,前面部分是为了说明存在潜在的应用,特别是敏感基因驱动。虽然技术障碍大,但至少从概念上讲,不是不可逾越。这些障碍包括与用CRISPR-Cas9 机器进行成功的基因组编辑兼容的杂草转化系统的开发和适宜分子靶标的确定。如2.1 所讨论,杂草基因驱动的最终成功取决于克服分子遗传限制和挑战,也取决于生态和进化(种群生物学)障碍。基因驱动的成功设计和实施取决于分子生物学家、杂草生态学家、分析员和进化生物学家之间的合作。

成功的杂草基因驱动主要的特性是什么。编辑基因将需要在种群中扩散到足够高的频率,能够在一定的时间段内足以控制种群。模型研究表明基因驱动把编辑基因扩散到在天然种群中固定的程度所需的时间为10~20 代,这取决于编辑基因的适合度(选择系数)和CRISPR-Cas9 归巢和编辑反应的效率。用模型进行研究时有许多假设,这些假设可能违背杂草种群侵染农业生态系统的规则,许多笔者已经提出需要建模来开发基因驱动管理农业害物的潜力。
 
植物(杂草)品种有许多可能调节有效的基因驱动潜力的特异性特性,以下将详细讨论。
 
4.1 杂草基因驱动系统的种群生物学
 
许多重要的一年生杂草品种一年一代,这大大限制了基因驱动在种群中的扩散。Unckless 等人预测当最初释放到种群中的编辑基因的频率为0.001时,需要10~20 代才能在野生种群中固定驱动基因。杂草种群大;一种主要杂草品种的中度侵染具有的平均种子库密度为100 粒/m2,这意味着10 hm2 的种植田有1 000 万(107)个杂草,需要释放104 颗种子才能得到Unckless 等人在一个单独侵染的田中模拟的扩展率(所有其他相等)。减少要固定编辑基因所需的代数就需要增加释放率,但这在实践中有挑战性。特别是,要生产以此规模释放的含有基因驱动的种子受到技术和实践的限制,因为与大多数害虫相比,杂草植物一代时间很长,要繁殖释放所需量的基因编辑种群的时间长。
 
Unckless 等人的模型也假定基因驱动在随机交配的种群中扩散。此简化的假设不适用于许多杂草种群。虽然数种重要杂草品种异性杂交,但花粉分散距离有限,潜在地使基因驱动在种群中的扩散慢。在农田中,通过有意与播种作物种子混合,在整个田间释放编辑个体可能一定程度上缓减此限制。对自花授粉的杂草品种或多年生品种来说,基因驱动扩散潜力被严重限制,对通过营养体繁殖等无性繁殖的杂草品种来说基因驱动是不可能的。对于专性异型杂交品种,有基于归巢核酸内切酶基因对基因驱动回应的很强的自花授粉进化趋势。许多植物品种具有混合交配系统,基因驱动可能使种群偏向于近缘繁殖率增加。最后,考虑当地和引入的(基因编辑)种群间选择性交配的可能性也很重要,特别是开花、花粉散播时间有差异的种群。
 
总之,农业杂草的基因驱动潜在的成功和应用将取决于育种系统、遗传和生活史参数,基因资源和植物转化系统的构建。应用基因驱动管理重要的、全球抗除草剂杂草品种时,只能用于防治其中一些,而非所有重要品种(表1)。
 
表1 有潜力用于全球主要农业杂草的基因驱动
注:基因驱动系统用于管理杂草种群的潜力是由杂草主要生物学和遗传特性、全球分布和防治难度(在此以除草剂抗性风险表示)来决定的。杂草品种的繁殖方式决定了基因驱动的固有能力,因为驱动将通过异性杂交品种成功扩展编辑基因。杂草主要被分类为异性杂交或自花授粉。高繁育力品种最可能有最大的种群,使基因驱动显著压制种群的时间长。相似地,持久种子库将使基因在种群中的增殖速率减慢。对5 种作用机制的除草剂产生抗性的品种具有非常高的抗性风险,对2 种或更少作用机制除草剂产生抗性的品种有中等风险。对多倍体品种和具有大的未测序基因组的品种来说,基因靶标的确定将更复杂。基因组<500 Mb 的品种被认为具有小基因组,500 Mb-2 Gb 基因组为中等大小基因组,˃2Gb 为大基因组。
 
5 总结、前景和下一步工作
 
近年,基因驱动技术的快速发展值得农业杂草(和害虫)管理相关人员的关注。作物保护系统对技术和农业生态创新的需求巨大,基因驱动是直接操纵害物基因组的全所未有的力量:⑴ 能把适合度降低的性状引入野生害物种群并扩散,近而压制种群的发展;⑵ 使种群(或再敏化)对新(或现有的)防治技术敏感。
 
基因驱动使用和监管的伦理、社会、生物安全和生态挑战相当的大。压制驱动是编辑基因能够不可控制地在天然系统中野生害物种群中扩散,导致害物种群大幅下降(甚至可能绝灭)。不断有文献介绍基因驱动的风险和严格管理的需要,也提出许多方法限制编辑基因的扩散和在实验室和天然环境中使其恢复原样来保护基因驱动。本文对基因驱动用于杂草管理的技术可行性和实际应用的介绍有限,但应当认识到对于基因驱动的实际应用来说,基因驱动的监管和伦理问题可能比技术难题更有决定性作用。农业害物是通过食草、传播疾病、致病和竞争资源使作物减产的生物。更广义的话,包括杂草的大多数害物是农业生态系统不可或缺的部分,其不受欢迎是因为其数量太多,造成作物产量减少,而不是其在生态系统中固有的存在引起。许多害物对农业生态系统的群落结构和生态系统功能甚至可能有积极的作用。笔者认为使害物品种绝灭的基因驱动不会受欢迎,严格的监管可能会禁止此种基因驱动的应用。不过,基因驱动用于局部根除害物是可以的,应该指出基因驱动靶标性很强,能大幅降低当前作物保护策略的脱靶标影响。
 
敏化驱动,特别是逆转抗性进化等敏感驱动可能不存在生态和伦理问题。逆转除草剂抗性的基因驱动具有内藏的“安全保护”机制。在遗传水平,通过人类直接选择抗性等位基因使抗性个体和种群恢复为原来的野生型敏感状态。敏感驱动不需要引入降低天然环境中害物适合度的编辑DNA。受争论的是这些驱动是否能使抗性种群恢复为人类干预前的基因状态。按照定义,敏化基因驱动联合应用化学防治剂(或其他管理技术)才能压制害物种群,故不存在不受时间和空间限制的防治。在未来监管框架下,这些敏化驱动最有可能成为新颖、遗传防治杂草策略。
 
技术可行性和监管挑战可能最终决定基因驱动在未来管理农业杂草的潜力。然而,只有基因驱动在合理的时间框架内在种群中有效扩散,这些考虑才有意义。以下因素会限制基因驱动的应用:杂草的生物学、生态学、生活史和种群动态,以及种群对基因驱动系统和基因编辑的防治策略快速进化抗性的潜力。在许多方面,这些限制易被解决,可用模拟模型评估在对归巢反应效率、释放率、种群大小、杂草种群动态和杂草交配系统假设的情况下基因驱动在杂草种群中扩散率和效率。严格评估基因驱动进行杂草管理的潜力,第一步,优先进行模型研究弄明白应用领域和评估决定成败的重要因素。这些模型研究也应该考虑杂草的直接遗传防除如何与杂草管理的化学药剂、栽培和物理方法相结合来设计在一定时间内防治杂草而降低抗性迅速进化的基因驱动系统。可能有许多障碍,此技术可能最终也不能用于实际生产中,但考虑到急需杂草管理创新,必须要对所有潜在的未来技术进行充分的研究。
 
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来源: 世界农药
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