急性经口毒性实验方法的比较与选择-世界农化网

孙贵娟

市场总监

世界农化网中文网报道：国内外的农药管理机构在对农药进行安全评价时，农药的急性毒性实验是必不可少的。通过研究实验哺乳动物在不同接触途径（口腔、皮肤、呼吸道、眼睛）下对农药的中毒反应，来推测该农药对人类、家畜等的毒性大小，从而为安全生产、储存、运输及使用农药制定指导性文件。

1、急性经口毒性的概念

急性经口毒性（acute oral toxicity）：

机体一次或24h内多次经口接触外源化学物后在短期内（最长14天）所产生的毒性效应，包括一般行为和外观改变、大体形态变化以及死亡效应。

2、急性经口毒性试验的目的

1）求出致死剂量及其他急性毒性参数

2）观察中毒表现、毒作用强度和死亡情况，初步评价毒物的毒效应特征

3）为其他毒理试验提供接触剂量和选择观察指标的依据

4）为毒理学机制研究提供线索

3、急性经口毒性的参数

半数致死剂量：LD50

4、实验要点

(一)健康实验动物的选择和性别鉴定。

(二)实验动物称重、编号和随机分组方法。

(三)受试化合物溶液的配制。

(四)小鼠灌胃技术。

(五)毒性症状的观察和LD50计算。

5、国际通用的几种急性经口毒性实验方法

传统的急性经口毒性试验多采用霍恩氏法和改良寇氏法。我国过去普遍采用的急性毒性的评价方法大体上可以归为两类：一是死亡率剂量反应要求为正态分布的，其中概率分配图解法和寇氏法（Karber）较为常用；另一类是不要求为正态分布的（非正态分布），查对有关表格即可得到LD50值，如霍恩氏法（Horns）等。

目前中国主要采用三种急性经口毒性试验方法，分别为霍恩氏法、序贯法（up-and-down procedure）、概率单位法（Miller and Taninter’s method）。具体方法可参看中华人民共和国国家标准GB/T 15670-2017 （农药登记毒理学试验方法）第2、3、4部分内容。

美国EPA农药登记推荐的方法是OPPTS 870.1100，实际内容与OECD 425 （up-and-down procedure）一致。

经济合作与发展组织（OECD）发布的几种急性经口毒性实验方法指南：

OECD TG420 - 固定剂量法（Fixed dose procedure(FDP)）、OECD TG423 - 分级试验法（Acute toxic class method (ATC)）和 OECD TG425 –序贯法或上下移位法（Up-and-down procedure (UDP)）是目前国际上通用的3种主要的LD50测试替代方法（2002年开始取代了最早的OECD 401-Draize法）。

三种OECD方法的相同点与不同点比较

相同点：

1）都非常强调对动物染毒后的仔细观察和记录,皮、毛、眼睛、黏膜的改变,呼吸、循环、植物神经系统和中枢神经系统、运动和行为等临床体征的观察可以提供许多有价值的信息。

2）试验结果都在不同程度上受起始剂量的影响,在实验设计阶段要求尽可能获取受试化学物的相关资料,包括毒性与结构关系的分析等,从最合适的剂量开始试验,将有利于取得最好的结果。

3）还有1个共同点是引入了“人道主义处死”的概念和要求,承受剧烈疼痛和痛苦的垂死动物应人道主义地处死,这类处死的动物在结果处理时以实验中死亡计。

4）都使用单一性别动物(推荐采用雌性动物,因为一般情况下雌性更敏感) 。

不同点：见下表

	OECD TG420-固定剂量法（HDP）	OECD TG423-分级试验法（ATC）	OECD TG425-上下移位法（UDP）
方法的发展	1984年英国毒理协会提出，OECD 2001年作为指南TG420	1990年Sumiey提出，OECD于1996年采用，于2001年更新列为指南TG423。目前欧洲使用此方法比较普遍。	1948年Dixon和Mood首次提出，OECD于1998年采用，2006年更新列为指南TG425。
原理简介	固定5,50,300,2000mg/kg四个剂量组，（必要时可以增加5000mg/kg)，依次使用同一性别的动物（一般为雌性），经口染毒。根据预试验结果，确定会发生毒性反应，但不产生严重的毒性反应或死亡的剂量作为起始剂量进行试验，再根据观察的结果调整毒性剂量，当出现以下情况时终止试验：1，当出现明显的毒性反应或已确认不多于1只动物死亡；2，最高剂量未出现毒性反应；3，最低剂量动物出现死亡。	试验分为若干阶段，每阶段使用3只动物，最多6只动物。已设计四个固定的剂量5,50,300,2000mg/kg，选定一个初始剂量进行试验，根据试验结果（动物死亡或者濒临死亡的动物数量）来判定是否进行下一步试验或者终止试验。有三种可能的结果：1，无需进一步试验即可分级；2，同一剂量水平再做3只动物；3，在高一级或低一级剂量水平另做三只动物。	由限度试验和主试验组成，限度试验分为2000mg/kg和5000mg/kg两个剂量水平，用于受试物毒性较小的情况，两种剂量限度试验过程有细微差别，但最多只用5只动物。主试验是一个预先设定的染毒程序，每次染毒1只动物，有1只动物染毒后的反应决定第2只动物接受染毒的剂量，若动物存活，第2只动物给予高一级剂量，若第1只动物死亡或出现濒临死亡的状态，则第2只动物给予低一级别剂量。在对每只染毒动物观察48小时候，可以决定是否对下一只动物染毒以及确定染毒剂量。当满足停止试验的标准时，可以结束试验。
每次使用动物数量	5-7只	平均7只	6-9只
每次试验动物死亡数量	1只	2-3只	2-3只
每剂量水平使用动物数	5只	3只	1只
全部试验最多所需动物数	20只	12只	15只
实验动物数	只需10～20只动物（预试一般不超过5只动物；主实验：每个剂量最少用10只动物，雌雄各半）	6-12只动物（2000mg/kg 限量试验:6只动物; 5000mg/kg: 3只动物; 主实验:最多12只）	限量试验: 最多5只；主实验: 通常4-6只，最多15只
剂量选择	限量实验: 2000 or 5000mg/kg bw; 主实验: 5,50, 300, 2000mg/kg bw	限量实验: 2000 or 5000mg/kg bw;主实验: 5,50, 300, 2000mg/kg bw	限量实验: 2000 or 5000mg/kg bw; 1.75 、5.5 、17.5 、55 、175 、550 、2000 mg/kg （或有特殊要求时1.75 、5.5 、17.5 、55 、175 、550 、1750 、5000 mg/kg
观察的指标	不以动物死亡作为研究的终点，而是以毒性发展的临床体征的观察作为终点，对化学品急性毒性进行分类。	用于危害评估危害分类，以及危害度评价，它是以动物死亡作为试验终点的分阶段试验法。	以动物的死亡作为研究的重点，同时进行毒性表现的观察。
LD50的值和置信度	不能精确估计LD50的值和LD50的置信限，但是可以粗略的估计LD50的范围。同样对于死亡剂量反应曲线的斜率和置信限也无法估计。	不能精确估计LD50的值和LD50的置信限，但是可以根据提供的数据使用最大相似法进行计算。该方法也适用于死亡剂量反应曲线的斜率和置信限的估计。	不但可以进行毒性表现的观察，还可以估算LD50及其可信度，适用于能引起动物快速死亡的受试物。不适用于有迟发型毒性反应特点的物质。
应用情况	采用这种方法的实验室较少	普遍使用，大部分国家接受	美国、中国推荐使用
特点	固定剂量、观察动物反应,不以死亡为依据,而且按毒性症状来判断该物质的危险程度	每阶段3只动物，2-4阶段即可判定急性毒性。死亡动物数一般不超过3只。	节省实验动物，同时，不但可以进行毒性表现的观察，还可以估算LD50 及其可信限。死亡动物数一般不超过3只。