ADME——当前杀虫剂研发的主要关注点

 

在医药领域，一旦确认了一个重要的市场需求或疾病，就需要根据病理生理学知识、已知的分子作用机制和相关化学研究来选择有价值的治疗靶标。根据初期假设所提出的药物进入途径、分子靶标位点进行研究，往往具有较大的风险。通常，关于 ADME 的研究会被部署于药物开发阶段，因为如果要使已经投入应用的药物同时满足靶点和 ADME的要求，需要复杂的化学改造过程。另外，制药公司将现有的医药发现模型转化成有效的人类药物的过程中，将面临许多困难，因为在临床试验前，研发者不能对人体进行测试。这就要求研发者在病理生物化学，药物的理化性质和 ADME 特性上进行深入的了解。即便如此，将药物最终商业化的进程也往往非常困难及昂贵。

 

通常，在农药研发初期，农药公司针对化合物对有害生物的活性进行广泛的测试。这一手段相比医药研发模式具有一定优势，其筛选过程可以直接针对研发目标的作用对象（有害生物），所有的害虫靶标均存在于筛选过程中，而且能够通过初步筛选的化合物也已经具有克服各种 ADME 障碍的性质。此外，只要化合物能获得良好的杀虫活性和非靶标生物安全性，对其靶标的确认并不重要。但是，不同于医药行业，农药的经济价值在于尽可能降低生产成本，因而经济、高产的合成工艺十分重要。这一要求很大程度上限制了同时满足与靶点的结合力和ADME 要求的小分子结构的可选范围。此外，一个成功农药（特别是杀菌剂和杀虫剂）在多种作物上的生物利用度参数十分复杂，将实验室得到的成果转化至大田环境往往非常困难。

 

然而，即使受到环境的复杂性和农药成本的约束，为什么仍然要在农药研发阶段对生物利用度及ADME 进行相关研究，而不是完全依靠生物活性筛选结果来优化先导化合物呢？因为在化合物结构优化过程中，对活性化合物作用机制的解读同样重要，而活性筛选仅能为此提供粗略的信息。

 

人们应该意识到，ADME 及生物利用度的相关问题常常会在研发过程中导致高经济风险及不确定性，从而限制先导研究的发展（生物活性优化），针对作用机理的研究可以帮助解决这些问题。尽管具有杀虫活性的先导化合物在被筛选出的过程中已经克服了 ADME 的若干障碍，但仍不具备商品化农药的活性水平、杀虫谱及选择性。因而，公司在 ADME特性研究上应该投入相应的资源和人力，并且联合化学家、害虫生物学家和靶点生物化学家，共同确定解决问题的办法。这些先导化合物可能出现的问题有：（1）对靶点作用强，但是对有害生物活性差；（2）具有高杀虫活性，但对非靶标生物毒性大，无法登记；（3）对某种害虫具有很好的杀虫活性，但是对相近目或种类害虫活性低甚至无活性；（4）在作物中传导性差，持效期较短，不足以杀死害虫，或不能达到商业利益最大化。

 

因此，农药研发是否成功，很大程度上取决于一个研发机构能否快速应用ADME及靶点知识来解决问题，从而经济高效地构建和执行项目。

 

本文将从毒理学角度讨论 3 个杀虫剂的研发历程。每个实例都描述了 ADME 如何与作用靶点、靶标生物方面的研究成果相结合，为解决研发过程中的关键问题提供思路与方法。这些实例中，先导化合物的特性均得到了最优化，并最终成功商品化。ADME技术如能持续发展，得到合理应用，其在未来的农药研发及先导化合物优化中将扮演重要的角色。

 

 

邻甲酰胺基苯甲酰胺类杀虫剂氯虫苯甲酰胺是杜邦（Du Pont）公司近年来大力推广的产品，其设计灵感来源于日本 Nihon  Nohyaku 公司的产品氟苯虫酰胺。这 2 种化合物均主要作用于昆虫鱼尼丁受体。这类杀虫剂的发现引致现代农药化学、靶标认知以及害虫防治的革命。

 

在明确了氯虫苯甲酰胺对咀嚼式口器害虫的防效之后，从 20 世纪 90 年代末到 21 世纪初，美国杜邦公司进行了对刺吸式口器害虫具有防效的邻甲酰胺基苯甲酰胺系列衍生物的研发。研发团队认为，如果要提高该类化合物在作物体内的内吸性，除了通过降低化合物 log P 值，还要同时开展改造后的化合物在作物体内的渗透与内吸性试验。于是，合成化学家拥有了化合物对刺吸式口器害虫的活性、通过 HPLC-MS 和生物测定得到的化合物在植物体内经由木质部和韧皮部的转运情况、物理性质等大数据，设计化合物要平衡多个优化因素。在淘汰了若干具有优异内吸性但活性较差的化合物之后，该团队最终通过将氯虫苯甲酰胺结构中苯环上的氯原子替换成氰基（图 1），成功获得了活性优异的化合物溴氰虫酰胺。该化合物在植物体内的木质部输导性及叶面渗透性明显增强，对蚜虫、叶蝉与稻飞虱、粉虱、鞘翅目害虫和双翅目害虫的生物活性显著提高，同时也保持了该类化合物对鳞翅目害虫优异的杀虫活性。溴氰虫酰胺在植物体内的转运情况及研究方法已有深入的报道。该研究同时也发现，溴氰虫酰胺是一种强力的鱼尼丁受体激活剂，其效果与氯虫苯甲酰胺相当。

 

本例通过一个简单的结构改造就显著提升了化合物在作物中内吸性与叶面渗透性，对刺吸式口器害虫的毒性增加。因此，ADME 相关研究结合大数据分析，在溴氰虫酰胺的发现过程中发挥了很大的作用。

 

 

 

20 世纪 70 至 80 年代，荷兰 Philips-Duphar 公司首次报道一类含二氢吡唑类结构杀虫剂，随后Rohm-Haas 公司也发表了相关化合物研究文章及专利。这类结构中的一些化合物体现出了优异的杀虫活性。Vincent  Salgado 博士在研究中认为这些化合物是类似于局部麻醉剂的钠离子门控通道阻断剂，这一观点随后被通过神经细胞的²²Na⁺吸收和电压钳试验所证实。20 世纪 80 至 90 年代，又有几类基于酰胺骨架结构的二氢吡唑类杀虫剂被发现并获得专利。然而，此类杀虫剂的工业化进程发展十分缓慢，原因不是由于化合物本身的杀虫活性不高，而是因为它们可持续存在于哺乳动物体内，并伴有缓慢、积累性的神经毒性，且在环境中降解缓慢。杜邦作物保护公司意识到这一问题后，针对问题的解决方案以及杀虫活性的进一步提升，对该类化合物展开了进一步的研究。

 

1990 年，Keith Wing 博士加入了美国杜邦作物保护公司，组织了一支集合多名优秀化学家和生物学家的团队，首次开展了对钠离子通道阻断杀虫剂（sodium channel blocker insecticide，简称 SCBI）候选化合物在哺乳动物体外与体内代谢情况的测定。关于 SCBI 的化学研究始于二氢吡唑结构衍生物，之后扩展到氧化吲唑类、吲唑类、缩氨基脲、吡唑啉类、哒嗪类、三嗪类和噁二嗪类结构。团队针对该类化合物对鳞翅目害虫的生物活性、哺乳动物代谢和环境残留的情况，对化合物结构进行了优化。为确保项目平稳进行，团队中的合成化学家、生物化学家和生物学家时刻保持密切交流，从而能对整个系列的化合物均进行深入了解。最终，团队发现了一种活性优异、在哺乳动物体外及体内具有良好代谢能力、环境易降解的噁二嗪类候选化合物，命名为茚虫威（图 2）。该化合物在昆虫体内经 N-去甲氧基羰基代谢酶代谢，降解成具有杀虫活性的昆虫钠离子通道阻断剂 DCJW（DPX-JW062 的 N-去甲氧基羰基代谢物；当前体农药是含有对应异构体的DPX-MP062 时，其活性代谢物是 DCMP）。在哺乳动物体内，茚虫威通常可被降解，表现出与其他大多 SCBI 类化合物不同的安全特性。近年来，日本Nihon Noyaku、德国巴斯夫（BASF）和美国辉瑞动物安全部开发了另一个 SCBI 类杀虫剂氰氟虫腙。

 

杜邦公司成功开发 SCBI 类杀虫剂的历程给了人们重要的启示。首先，通过团队合作交流，结合多方试验结果来设计并优化先导化合物，确定农药在环境中的代谢途径，能够解决长期困扰农药产业的若干问题。第二，组织团队成员进行定期交流，便于整个团队对杀虫活性、环境降解及代谢稳定性等信息达成深入的了解，以及组员对新思路或新化合物进行迅速的尝试。第三，在茚虫威这个项目中，团队同时针对噁二嗪核心骨架（通过对 SCBI 系列化合物进行大量筛选而确定的）及侧链取代基进行修饰，为研发工作提供了大量在哺乳动物体内可降解性、杀虫活性方面各不相同的化合物。代谢性质优越的 SCBI 类杀虫剂开发成功，得益于整个团队对以上几点的良好实施，这也需要团队耐心和有条理的工作，对先导研究结果进行深入的理解。

 

 

Rohm-Haas 公司的二芳酰肼类蜕皮激素（dibenzoylhydrazine ecdysone，简称 DBH）受体激动剂研发历程非常独特，为后来农药研发与应用提供了宝贵的经验。Keith Wing 博士和 Glenn Carlson  博士曾经与哈佛大学生物实验室的 Carroll  Williams 教授（昆虫生理学之父）以及他团队中昆虫发育/分子生物学家 Louis Safranek 博士、Peter 和 Lucy Cherbas开展过密切合作。在此期间，Keith  Wing 博士认为昆虫蜕皮激素的生理途径是一种潜在的杀虫剂靶标，并于 20 世纪 80 年代早期开展了相应的研究。

 

与此同时，Adam Hsu 博士在合成一类含单苯甲酰结构的化合物过程中，通过对一种含二芳酰肼结构的副产物进一步纯化以及生物活性测试，意外地成功合成出第一个蜕皮激素类活性化合物。二芳酰肼类化合物是一种与众不同的昆虫生长调节剂（insect growth regulator，简称 IGR），可以导致鳞翅目幼虫口器畸形。一些猜测认为该类化合物作用方式与双酰基脲类 IGR（如灭幼脲）一样，但 Keith Wing博士在将酰肼类化合物作用于 4 龄至 5 龄的烟草天蛾（Manduca  sexta）幼虫后，意外发现其能迅速导致幼虫异常蜕皮，且生效时间明显早于双酰基脲类化合物。在与 Williams 教授团队的合作下，Keith Wing博士于 1984 年至 1987 年期间，在 Rohm-Haas 公司实验室针对这一现象进行了一系列后续试验，并有一些新的发现。

 

 

首先，在果蝇 Kc 细胞系中，叔丁基 DBH  RH 5849 作为3H-尖叶土杉甾酮 A 与蜕皮激素受体结合的直接竞争者，与蜕皮激素的生理反应相同。在抗DBH 细胞系与蜕皮激素抗性细胞系对两类化合物都存在交互抗性。在代谢和转运机制并不是影响因素的试验中发现，无论从哪方面来看，RH  5849 的作用与昆虫蜕皮激素 20-羟基蜕皮酮相同，但其活性只有后者的 1/100。

 

第二，正常烟草天蛾（Manduca  sexta）幼虫和腹部被结扎的幼虫用 RH 5849 处理，均能引起过早蜕皮，且其活性比 20-羟基蜕皮酮高几个数量级，特别是在经口饲喂的情况下（DBH 类化合物经皮吸收活性稍弱）。结果发现，烟草天蛾幼虫经口饲喂¹⁴C-RH 5849 后，化合物在血液中的浓度在 7 h 时达到最高，甚至 45 h 后仍能保持毒理学残留的显著水平。与此相对应的是，在正常幼虫中，20-羟基蜕皮酮浓度在幼虫发育中期时达到最大，之后在幼虫正常蜕皮之前被代谢酶降解至不可检测水平。由此推断，RH 5849 在昆虫体内的残留水平能够导致幼虫早熟蜕皮，从而在发育完备前强迫蜕皮，且在形成新表皮之后仍无法蜕皮完全。另外，由于残留的 RH 5849对中枢神经内分泌系统的影响，正常的神经激素（如促前胸腺激素和促蜕皮激素）级联反应信号必然会受到扰乱。此外，蜕皮激素放射免疫分析表明，RH 5849 处理能强烈抑制内源 20-羟基蜕皮酮的峰值。这不仅排除了 RH 5849 系列化合物的作用机制是诱导蜕皮激素分泌，而且证明了该类化合物对幼虫大脑和前胸腺中枢神经内分泌反射区具有强烈的抑制作用。

 

研究结果还显示，DBH 系列衍生物与果蝇 Kc细胞系受体间的亲合力与衍生物刺激烟草天蛾幼虫过早蜕皮的能力密切相关，而且这些 DBH 衍生物在鳞翅目幼虫体内具有相似的 ADME 性质。因此，该类化合物对印度谷螟和黄瓜甲虫细胞系的相关试验得以开展，以期能扩宽该类化合物的杀虫谱。作者在 Rohm-Haas 公司完成了所有的细胞系和受体准备以及昆虫活性筛选的工作，由此验证化合物的构效关系。此项研究中，这支由合成化学家、生物化学家与生物学家所组成的团队共同设计并成功商业化了三个具有较高受体亲和力和杀虫活性的化合物：虫酰肼和甲氧虫酰肼（主要防治鳞翅目害虫）、氯虫酰肼（主要防治鞘翅目害虫）（图3）。由于成功研发了虫酰肼等对非靶标生物安全、对环境友好的杀虫剂，Rohm-Haas公司于1998年获得了美国总统绿色化学挑战奖。随后，另外两个具有相同作用机制的化合物被日本曹达/三井公司以及江苏省农药研究所成功商品化。

 

  

 

此外，对 DBH 类化合物作用机制的揭示，明显提升了以下 2 个领域的研究力度：（1）农药公司对可作用于蜕皮激素受体的其他化合物的相关研究；（2）对 DBH 和天然蜕皮激素在受体上的结合位点，以及与其他种类昆虫蜕皮激素受体相关的分子生物学基础研究。

 

果蝇蜕皮激素受体（EcR）于 1991 年首次被成功克隆。随后，试验证明了蜕皮激素受体首先需要和超气门蛋白（ultraspiracle，USP）形成二聚体，进而与蜕皮激素激动剂结合形成复合体，转录激活下游蜕皮激素响应元件。在接下来的几年里，许多其他目的昆虫蜕皮激素受体和超气门蛋白被克隆和表达。由于蜕皮激素受体和超气门蛋白结合的特性，极大引起了人们对此类靶点相关研究的热度，分子生物学家和生物化学家据此构建多种无细胞和细胞系高通量筛选平台。

 

最后，在研究中也发现了其他能与 EcR/USP 复合体结合并选择性转录的化合物类型。关于此类研究领域，目前已有文献进行全面的综述。虽然寻找高效的 DBH 化学替代品非常困难，对控制农业害虫、无脊椎动物传病媒介的持续需求将维持本领域研究的不断进行。由于此类化合物的作用靶标仅存在于无脊椎动物中，因而从机理上保证了对哺乳动物的安全性。

 

另外一个由蜕皮激素激动剂/DBH 相关研究带来的好处是，基于此类基因模式调控系统，可以根据需要设计出具有特异性的配体/基因开关组合，从而实现对特定多肽或蛋白的过表达，最终用于人类健康方面的研究。这一设想最初是在 Rohm-Hass 公司进行 DBH 杀虫剂研究时提出的，也因此导致子公司 Rheogene 的建立。在这种情况下，药物 ADME的概念也被应用于一系列作为基因开关的配体结构的设计。这项技术最终转让给匹兹堡大学药学院，并被合成生物学公司 Intrexon 收购。当前，Intrexon公司正在与 Ziopharm Oncology 公司、Merck Serono公司与 M.D.  Anderson  癌症中心合作，共同应用基因开关技术，选择性地激发白介素-12 的表达，用于对黑素瘤、乳腺癌和神经胶质瘤的控制。该研究不仅获得了良好的预期效果，还计划将成果推广于其他疾病的防治。研究人员开创了这项技术在农业领域的初期发展，也希望它对人类健康能有潜在的使用价值。因而，这项技术能在治疗人类重大疾病方面占据一席之地，让研究者倍感欣慰。

 

整个发现历程具有一定意外性，归功于研究成员细致的观察、对偶发时机的把握以及良好的相互协作。研究始于一个活性低但意义重大的天然甾醇蜕皮激素类似物，其独特的 ADME 特性使其能长时间存在于昆虫体内，破坏多种依赖于蜕皮激素的机能。通过对先导化合物进一步优化，所得到的衍生物在昆虫尤其是鳞翅目昆虫体内，与蜕皮激素受体的结合能力得到了显著的提升。在此基础上，许多研究者得以针对双翅目、同翅目、鞘翅目昆虫中以及其他类型的蜕皮激素受体寻找具有结合能力强的化合物。整个研发历程很好地示例了，针对作用靶标的研究是如何结合对关键 ADME 性质的理解、对昆虫生理学和害虫生物学的认知，共同指导合成化学走向全新的领域，协助先导化合物的优化，找到最理想的化合物。最后，Keith  Wing 博士认为，可能还有其他相对长效的激素激动剂或者神经递质（如优于新烟碱类杀虫剂）类似物有待被发现，并且成为活性优异的杀虫剂先导化合物。 

 

 

杀虫剂的渗透/分布/代谢/分泌（ADME）性能是当前许多研究的主题。本文结合了几种前体农药的研发过程，为农药研发机构提供了一个重要的工作基础，也为正在面临 ADME 难题的公司指明了选择方向。 

 

本文中的实例显示，深入表征先导研究中的ADME 特性和靶点，采用协作方式解决问题，是在农药及药物研发中取得进展的关键。只有联合具有不同背景的团队成员，共同设计试验方案并分享数据及想法，才能将先导研究成功转化为研发进展、农药登记，甚至能在化合物商业化后继续给予支持。 

 

最后，一支农药研发团队需要全面的多学科背景与技术支持，才能在优化先导化合物过程中具有创造性、发散性的思维，提高解决问题的能力，并在最大限度上提升投资收益和减少不必要的开销。只有在这样的团队里，才能使化学家在探索密切相关的衍生物或者其他相关药效基团、创建多样化的结构活性模型的过程中，确保研究对象符合不同生物水平的要求。尽管当前各个行业均关注研发成本，但正由于追求这种具有高风险意识、审慎且高效的工作方式，本文所介绍的团队与技术能够在获得收益的同时，对农药科学的内涵得到更深入的理解。这对于 21 世纪现代农药发展有着极为重要的意义，因为在这一阶段的新产品，通常要求在具有内吸性的同时，可适用于多种应用方式，并能接受多种成分的混配。因此，结合对农药应具备的理化性质的关注以及对植物吸收、转运和代谢过程的认识，对设计满足现代农药标准的新农药具有持续性的指导意义。在过去的 10 年里，一系列具有优异的输导性和高活性的农药得到登记，表明了这些策略已经在一些农药公司中得以实施。