植物内源生长调节剂天然芸苔素甾醇晶型技术获重大突破

日期:09-20-2022

世界农化网中文网报道：植物生长调节剂的应用是农业五大新技术之一，其具有使用投资小、见效快、用量微达ppm级(百万分之级)、效果显著、投入产出比极高等特点。随着农业生产技术的发展，植物生长调节剂的作用越来越重要，一方面能进一步提高作物产量，另一方面调节剂能提高植物自身免疫力，发挥保健作用、减少农药用量和恶劣气候对农作物的损害。植物生长调节剂的研究及其在生产上的应用，是近代植物生理学及农业科学的重大进展之一，世界各国的农业科学家都高度重视这一领域，植物生长调节剂的应用已成为农业科技发展水平的重要标志。

一、全球极端天气频发影响农业生产，抗逆类植物生长调节剂发挥越来越重要的作用

农业是国民经济的基础，气候是影响农业生产的重要决定因素，气候变化对农业所带来的不利影响，特别是极端天气气候诱发的自然灾害将会造成农业生产的波动，农业病虫害发生范围扩大，危害程度加重，农业成本和投资大幅增加。同时，气候变化引起的气象灾害频繁发生，农业生产的不稳定性增加，将对农业生产条件、农业自然资源以及农业自然灾害等方面产生深远影响。植物生长调节剂可以调控作物本身、提高抗性的潜力，作物对植物调控产品（植物生长调节剂）的技术性需求越来越重要，市场对作物抗逆投入品的需求正在迅猛增加^[1]。

二、农业产业结构的调整，植物生长调节剂抗逆功能发挥的价值越来越大

国际经济一体化的发展趋势，迫切要求我们调整农业结构，集约高效、机械化、信息化、无人化、反季节作物栽培、水果类品种的优育技术、设施农业如大棚蔬菜等变化，对作物的精准调控需求越来越高，作物的正常生长、产量和品质越来越离不开植物生长调节剂的应用^[2]。

三、芸苔素甾醇—最具抗逆功能的第六大类植物生长调节剂

针对全球低温、干旱、高温等非生物胁迫对农业生产带来的粮食安全、品质安全和质量安全问题，芸苔素作为安全、高效的植物生长调节剂，具有显著增强作物抗逆能力、提升作物产量和提升农产品品质的作用，其在农业生产中的应用价值越来越显著^[1]。

从20世纪30年代对生长素的研究开始，植物生长调节剂便得到了快速的发展，随后又陆续发现了赤霉素（GA）、脱落酸（ABA）、细胞分裂素（CTK）、乙烯（ETH）和芸苔素甾醇（BRs）等植物生长调节剂。在品类众多的植物生长调节剂中，芸苔素甾醇自发现之初就成为科学家热议的话题，芸苔素甾醇是一类在植物生长发育中起着多重作用的植物激素，由美国农业部科学家J.W.Mitchell等人在1970年首先从油菜属植物的油菜花粉中提取得到。1979年Grove等从蜜蜂采集的油菜花粉中分离出了4 mg的生物活性物质，通过晶体衍射分析确定了该种物质的化学结构，该化合物被命名为芸苔素内酯（brassinolide，BL）。1982年日本科学家Yokota等又从板栗的虫瘿中分离出了另一种类似于BL的生物活性物质CS（castasterone），并证明CS是BL的直接前体。随后，科学家们又从不同植物的多种器官中分离出了七十多种类似物，并将此类物质统称为油菜素甾醇类化合物（BRs）。直到1998年，第16届国际植物生长物质学会年会上芸苔素甾醇才被正式确认为第六大植物激素^[3,4]。

四、芸苔素甾醇的功能及作用机制研究进展

4.1 芸苔素甾醇的结构特点

BRs是一类植物甾醇激素，其基本结构是由ABCD四环组成的甾体核、B环上C6位的酮基和D环C17位的烷基侧链^[4]。A环和烷基侧链的羟基化水平及空间结构直接影响BRs与其受体复合物的亲和力，从而影响BRs生物活性，天然芸苔素内酯(brassinolide，BL)是目前已知活性最高、研究最透彻的芸苔素甾醇（图1）^[5]。之后人们以其分子结构为蓝本，人工合成了24-表芸苔素内酯、28-高芸苔素内酯、28-表高芸苔素内酯、混表芸苔素内酯、丙酰芸苔素内酯等多种BL类似物。

图1 天然芸苔素内酯BL的化学结构

4.2 芸苔素甾醇的生理功能及作用机制研究

BRs广泛存在于各种植物体内，从低等藻类、蕨类，到裸子植物、被子植物中已发现几十种不同结构的芸苔素甾醇，说明BRs的信号途径产生于植物进化的早期，且在植物中相对保守。BRs在植物体内主要集中在生殖器官、未成熟种子及幼嫩组织中，调控生殖发育、种子成熟，促进茎伸长及根形态建成，同时在植物抗逆境胁迫中起到积极作用^[6,7]。

BRs体内合成发生在合成部位细胞内质网，再经高尔基体分泌至胞外，然后BRs在效应部位细胞膜上被受体结合，进而激活细胞内一系列信号转导途径（图2）。细胞膜上存在BRs受体蛋白BRI1，以及受体复合物蛋白BAK1^[8]。当BRs不存在时，BRI1和BAK1分别与其抑制蛋白BKI1和BIR3相互作用，阻止BRs受体复合物的形成，使BRs信号通路处于关闭状态。细胞质蛋白激酶BIN2是BR信号的负调控因子，可使BRs转录因子BES1和BZR1磷酸化而滞留在细胞质，无法进入细胞核行使转录激活功能。当BRs存在时，受体蛋白BRI1胞外结构可与BRs结合，并引起细胞内分子结构发生变化，同时招募细胞膜上的受体复合物蛋白BAK1共同形成BRI1-BR-BAK1受体复合物，激活细胞内信号转导途径^[9,10]。

图2 细胞内BR信号转导途径

五、天然芸苔素甾醇的产业化

有报道表明，″芸苔素甾醇″的生产工艺分为源自天然提取和人工合成两种截然不同的工艺路线。资料显示，中国从事天然芸苔素提取技术的研究始于二十世纪八十年代初，最初是采用从蜂蜡中提取得到天然芸苔素活性成分。通过专利检索发现，由成都新朝阳作物科学股份有限公司（以下简称″新朝阳″）最早通过酶法定向萃取等新工艺技术获得天然芸苔素，并先后获得中国发明专利、PCT美国专利、PCT澳大利亚专利、中国农业农村部2016-2017年度神农中华农业科技奖科研成果二等奖。源自天然提取的″芸苔素甾醇″，以14-羟基芸苔素甾醇为标志性的产品由新朝阳在2017年首次获得中国ICAMA农药正式登记^[11]，同时也是全球首次登记并实现了产业化。人工合成″芸苔素″类似物的研究开始于1982年，世界各国都致力于人工合成芸苔素内酯，使低成本、大规模、工业化生产芸苔素内酯类物质成为现实。目前在中国已获得农药登记的人工合成芸苔素包括：24-表芸苔素内酯、28-高芸苔素内酯、22，23，24-三表芸苔素内酯、28-表高芸苔素内酯以及丙酰芸苔素内酯。其中，前四种芸苔素内酯均以BL为蓝本，根据其结构差异，生物活性也有所不同，而丙酰芸苔素内酯是经丙酰化的芸苔素，其本身并不具备生物活性，而需要吸收后经体内代谢才能发挥作用。

六、天然芸苔素甾醇晶型技术的研究

一种物质存在两种或两种以上的固体物质状态称为多晶型现象。固体物质的多晶型现象在自然界中普遍存在，且药物不同晶型物质如无机物一样，也会存在迥然不同的性质差异。药物的多晶型会直接影响药品的有效性、安全性和药品质量，这已经成为国际制药领域的共识^[12-15]。

6.1 天然芸苔素甾醇晶型技术研究

一般来讲，一种化合物都会存在多种晶型，然而晶型制备技术对有些化合物难度很大，且并不是所有制备的晶型都具有生物活性。在所有芸苔素中，天然芸苔素14-羟基芸苔素甾醇通过对能引起多晶型的化学因素，包括溶剂种类、数量、比例、饱和度等和物理因素，包括 温度、压力、速度、湿度等进行全面考察，得到了能够显著调控植物生长的天然芸苔素甾醇优势晶型，相比其他芸苔素甾醇类化合物，其生物活性在速效上提高50%以上，有效解决了市场上流通的其他芸苔素类化合物″见效慢″、″安全性不稳定″、″活性不稳定″的问题，3~5天可见明显的效果，同时在作物产量增加，抗逆生长，提高品质和改善农产品口感，增加光合作用方面有着十分重要的稳定作用和功能提升。

图3 天然芸苔素甾醇（晶型）对花粉萌发的影响

 

图4 常规培养条件下天然芸苔素甾醇（晶型）与不同芸苔素产品活性对比试验

 

 

图5 逆境条件下天然芸苔素甾醇（晶型）与不同芸苔素产品活性对比试验

6.2 天然芸苔素甾醇晶型PCT专利取得重大进展

2022年，由新朝阳原创研发的天然芸苔素甾醇晶型专利成功拿到PCT国际专利受理通知书，这意味着天然芸苔素甾醇晶型技术将可以在众多的国家申请获得知识产权保护。后期将根据该PCT国际专利检索报告评价情况适时向美国、加拿大、巴西等专利商标局提交下一步申请，以为其在全球范围内的知识产权提供保护壁垒。

图6 天然芸苔素甾醇晶型PCT专利受理通知书

七、未来与展望

14-羟基芸苔素甾醇作为一种广谱、高活性植物生长调节剂，因其生理活性独特，适用范围广泛，使用剂量超低，安全性极高，增产增收效果突出而成为植物生长调节剂市场知名度极高的生物农药品种。同时，随着农产品品质消费需求升级、全球农业绿色发展、粮食安全和生物安全发展战略的推进实施，天然芸苔素甾醇在推动农业绿色发展、高质量发展和提升农业价值中必将发挥越来越重要的作用。此外，随着天然芸苔素甾醇晶型技术的创新突破，以其更高的生物活性和安全性，必将进一步引领芸苔素行业技术发展和产业发展，在解决全球非生物胁迫和粮食安全问题中发挥更大的价值作用。 

 

参考文献

[1] 裴海荣, 李伟, 张蕾,等. 植物生长调节剂的研究与应用[J]. 山东农业科学, 2015, 47(7):5.

[2] 张雨欣, 丁俊浩, 邢苗条. 基于"区块链"技术的新型农业产业结构发展探讨[J]. 合作经济与科技, 2020(8):2.

[3] Mitchell, J.W., Mandava, N., Worley, J.F., Plimmer, J.R. & Smith, M.V. Brassins--a new family of plant hormones from rape pollen. Nature 225, 1065-1066 (1970).

[4] Michael D. Grove, G.F.S., William K. Rohwedder, Nagabhushanam Mandava, Joseph F. Worley, J. David Warthen Jr, George L. Steffens, Judith L. Flippen-Anderson & J. Carter Cook Jr Brassinolide, a plant growth-promoting steroid isolated from Brassica napus pollen. Nature 281, 216–217 (1979).

[5] Hothorn M ,  Belkhadir Y ,  Dreux M , et al. Structural basis of steroid hormone perception by the receptor kinase BRI1[J]. Nature, 2011, 474(7352):467-471.

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[7] 刘北城, 张艳艳, 戎亚思, et al. 干旱胁迫下喷施14-羟基芸苔素甾醇对冬小麦穗花发育及碳氮代谢的调控[J]. 植物营养与肥料学报, 2021, 27(6):12.

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[16] 李雪莹, 王静, 朱伟. 药物晶型类专利申请及其创造性审查[J]. 中国新药杂志, 2020(9):5.

（本文作者：李玉珠、黄瑾、马宝鹏）

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