活体眼睛刺激试验的体外替代方法

日期:12-01-2021

世界农化网中文网报道： 

Ramesh Verma博士自2008年1月起担任毒理学部的高级研究员。作为一名资深科学家，他在各种急性毒性和体外替代研究、监管研究和开发产品安全数据以提交监管审批方面成果显著。此外，他还担任放射性安全官，负责管理放射性同位素示踪设施。

为评估有害的被试物质对人眼的风险，需要进行眼部毒性测试。此外，角膜表面的位置、生理反应和敏感性使人的角膜经常暴露在各种潜在的危险化学物质中。各种化学物质都有可能损害角膜，程度从刺激到组织腐蚀不等，导致不可逆的致盲¹。

传统上，动物试验（如德莱赛测试）专门用于确定被试物质接触兔子眼睛后的眼部刺激潜在水平，评估由此产生的生物学反应^2,3。监管部门正试图取代、完善和减少用活体测试评估最终产品中的化学物质对人眼造成的风险，并已出台了减少动物试验、推广替代技术的法规。这些技术包括对死亡动物组织的器官型检测以及基于二维和三维检测的体外检测4。

在众多体外方法中，只有少数方法符合OECD的各种测试指南。JRF进行体外牛角膜浑浊和通透性试验（BCOP）和三维角膜上皮模型（采用SkinEthic™人角膜上皮（HCE）模型）试验，以确定被试物质的潜在眼睛刺激性，在某些情况下进一步将被试物质归入2A或2B类。根据现行的GHS分类系统，可以通过结合这些方法对被试物质进行归类。

三维角膜上皮模型

三维重建的人类角膜样上皮（RhCE）使用原代人细胞，这些细胞经过几天的培养后形成了一个分层且高度分化的鳞状上皮，形态上与在人角膜中发现的上皮相似。SkinEthic™ HCE组织结构至少由4个活细胞层组成，包括柱状细胞和翼状细胞，中间丝、成熟半桥粒和桥粒，以及人类特有的角膜细胞角蛋白。被测化学物质被局部应用于RhCE组织结构。在暴露并经后处理培养期后，活体染剂MTT （3-(4,5-二甲基-2-噻唑)-2,5-二苯基溴化四唑；噻唑蓝）在活细胞中的酶转化为蓝色MTT甲臜盐，通过从组织中提取并定量测定甲臜盐即可进行组织活性评估。该模型旨在区分无刺激性的物质和需要标记为GHS类别1或类别2的物质，但这种检测方式无法辨别GHS类别1和类别2。为此，需要采用其他体外测试方法做进一步测试⁵。

适用范围：

- 基于人体组织的模型

- 用于测试物质和混合物

- 可以在自上而下（首先使用能够准确鉴别严重刺激物的测试方法）和自下而上（首先使用能够准确鉴别非刺激物的测试方法）的方法中使用，先使用自下而上的方法。

- 测试不需要对眼睛危害进行分类的化学物质

局限性：

- 不建议用于鉴别应归类为眼睛刺激或严重眼损伤的化学物质。

- 不能测试气体和气溶胶 ⁶。

牛角膜浑浊和通透性试验（BCOP）

BCOP测试方法是一种器官型体外检测，使用从刚宰杀的牛眼中分离的角膜。被测化学物质被应用于角膜的上皮表面。被试物质造成的损害通过以下定量测量进行评估： 

i.角膜浑浊度变化，以透过角膜的光量测量；以及

ii.通透性，以穿过角膜全层的荧光素钠染料的量测量，用可见光分光光度计检测。

根据这些结果，被试物质被归入GHS类别1（即严重刺激性）、GHS类别2（即有刺激性）或GHS类别3（即无刺激性）。

该模型不能用于对属于GHS类别2A或类别2B的被试物质进行归类，需要使用活体研究进行进一步测试，因为没有体外测试能够将被试物质归入这一类别⁷。

适用范围：

-用于测试物质和混合物

-处理角膜效应，这是体外分类的主要驱动因素之一

- 可以在自上而下（首先使用能够准确鉴别严重刺激物的测试方法）和自下而上（首先使用能够准确鉴别非刺激物的测试方法）的方法中使用，先使用自下而上的方法。

局限性：

  - 对醇类和酮类的预测可能过高，对固体的预测可能为假阴性

  - 不适合评估与眼部接触有关的潜在全身性毒性

  - 不能测试气体和气溶胶 ⁶。

本文发布在《实验室及法规公司手册》杂志：

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References:

1.Wilson, S., Ahearne, M., Hopkinson, A., An overview of current techniques for ocular toxicity testing. Toxicology 327 (2015) 32-46.

2.OECD Guideline No. 405, Acute Eye Irritation/Corrosion, adopted by the Council on October 09, 2017.

3.Wilhelmus, K.R., 2001. The Draize eye test. Surv. Ophthalmol. 45, 493—515.

4.Lotz, C., Schmid, F., Rossi, A., Kurdyn, S., Kampik, D., Wever, B., Walles, H., Groeber, F., 2016. Alternative methods for the replacement of eye irritation testing. Altex 33.

5.OECD Test Guideline No. 492, Reconstructed human Cornea-like Epithelium (RhCE) test method for identifying chemicals not requiring classification and labelling for eye irritation or serious eye damage, adopted by the Council on June 18, 2019.

6.OECD (2019). Series on Testing and Assessment No. 263. Guidance Document on “Integrated approaches to testing and assessment (IATA) for serious eye damage and eye irritation (Second Edition). OECD, Paris.

7.OECD Guideline No. 437, Bovine Corneal Opacity and Permeability (BCOP) test method for identifying i) chemicals inducing serious eye damage and ii) chemicals not requiring classification for eye irritation or serious eye damage, adopted by the Council on October 09, 2017.

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