【专访JRF】安全性评估监管的趋势：体外替代方法

日期:03-11-2021

Rajendra Nagane博士介绍： Rajendra Nagane是微生物学博士，JRF公司毒理学助理主任兼遗传和体外毒理学系主任。他在遗传毒理学和与农业化学及制药相关的替代动物试验模型研究方面拥有15年以上的经验。目前，他的研究兴趣集中在减少动物使用的体外替代模型的开发上。Rajendra Nagane博士及其团队在JRF开发了不同的体外毒性试验模型，例如体外皮肤刺激和使用RhE皮肤模型的体外皮肤腐蚀，三个AOP驱动的皮肤体外测试致敏性模型（DPRA，角蛋白测定和h-CLAT测定）。他和他的团队在开发最新的体外遗传毒性试验（例如体外微核和小鼠淋巴瘤试验）中发挥了作用。他目前领导着一组科学家，他们正在对体外内分泌干扰物筛选测定法的最新更新指南进行GLP验证。他已经接受了IBSC委员会和生物安全官的职责。2019年，他在行业内具有较高影响力的期刊上发表了两篇论文，还有几篇论文正在筹备中。

近期，印度处于领先地位的CRO公司JRF Global的致突变和体外研究负责人Rajendra Nagane博士在接受AgroPages世界农化网采访时，谈到了JRF在全球农用化学品和专用化学品行业进行体外替代研究所做的努力。

监管机构正在减少动物试验，推广体外实验。JRF（JAI RESEARCH FOUNDATION）采取了什么主动行动来响应这个趋势呢？

JRF紧跟指导原则的最新进展，并持续监测全球法规发展的最新情况。JRF自2013年以来，一直为全球客户提供GLP体外替代试验。JRF目前完全采用了动物试验中的3R原则，即：用于“减少（Reduce）”测试所需的动物数量，有助于“替代（Replace）”一些动物试验，或“改善（Refine）”动物试验程序以减轻疼痛和痛苦的替代方法。体外试验方法使用（改造的）组织，整个细胞或部分细胞来进行研究。JRF可根据全球各种法规指南提供这些研究服务。

皮肤刺激性或皮肤腐蚀性可以预测吗？ 

根据化合物的pH值和物理化学特性可以初步预测皮肤刺激性和腐蚀性。此外，可以使用QSAR工具获取有关化合物性质的一些信息。

如何评估皮肤腐蚀性？ 

使用重建的人类皮肤组织（RhE）进行体外皮肤腐蚀性试验，以确定暴露是否对皮肤造成不可逆的损害，表现为表皮可见的坏死。使用活体染料MTT测定细胞活力，可用于区分活细胞和死细胞。

您能解释一下体外皮肤刺激现象吗？ 

皮肤刺激的结果是红斑和水肿形式的反应。该试验确定了受损的角质形成细胞释放中间体，从而引起了炎症反应。这项试验也是利用重建的人上皮组织进行的，正是内皮细胞的扩张和通透性增加，导致形成的红斑和水肿。本模型中由于不良反应导致皮肤刺激而释放的细胞内含物是通过酶促将活性染料MTT [ 3 - ( 4，5 -二甲基噻唑-2 -基) -2，5 -二苯基四唑溴化物，噻唑蓝]转化为蓝色甲酰胺盐，利用多模式微孔板检测仪从组织提取后，定量测定光密度。激发态产物通过其将细胞活力降低到规定阈值（即≤50％）以下的能力来鉴定。

在皮肤刺激性研究中，自上而下或自下而上的程序是什么？

如果预期试验项目是没有腐蚀性或刺激性的，则可以执行自下而上的程序。如果结果显示无刺激性，则首先进行皮肤刺激性研究（OECD 439），然后无需进一步测试。如果采用自上向下方法，则首先进行皮肤腐蚀（OECD 431），并且如果结果显示出皮肤腐蚀反应，则无需进一步测试。通常，当我们期望测试项目具有腐蚀性/刺激性时，使用自上向下的方法。 如果采用自下而上的方法，假如皮肤刺激明显显示为阴性反应，则无需进一步测试。可以根据可获得的理化数据确定测试的优先级，仅当我们没有明确的适应症时才需要进行动物研究。

什么时候不需要进行皮肤腐蚀性试验？ 

根据ECHA指南，以下情况不需要进行皮肤腐蚀性试验：

1. 强酸（pH≤2.0）或碱（pH≥11.5），现有资料表明应将其归类为对皮肤有腐蚀性（第1类）。

2. 室温下在空气中或与水或水汽接触时自燃。

3. 按经皮肤途径被分类为剧毒（第1类）。 

4. 通过皮肤途径进行的急性毒性研究并未表明皮肤受到刺激直至达到极限剂量水平（2000 mg / kg体重）。

JRF可以提供哪些体外皮肤致敏研究服务？ 

JRF根据“AOP-不良结果途径”原理提供了三个层级的体外皮肤致敏性试验。这一系列试验可将制剂分类为致敏剂和非致敏剂。以下事件促使形成致敏反应：

1. 使用DPRA分析测定肽反应性：当测试项目与皮肤蛋白接触时，其与皮肤蛋白共价结合。如果测试项目与肽结合，则游离肽会更少，并且可以测量由于Cys和Lys的加合物而导致的游离肽消耗，肽消耗超过6.38％则表示为致敏剂。 

2. 角质形成细胞反应：它是根据荧光素酶报告基因测试方法测定的。荧光素酶报告基因用于评估角质形成细胞的激活，增加的数量≥1.5倍表示为致敏剂（细胞活力≥70％）。 

3. 树突状细胞反应：测量CD54和CD86细胞标志物的核心表达。测量CD54和CD86的过表达，以评估测试项目的致敏潜力。

DPRA技术的局限性是什么？

DPRA技术的局限性在于，对于低溶解度化合物，复杂混合物，无法与七肽摩尔比测试的天然化合物以及有助于半胱氨酸二聚体的化合物，它可能无法提供结论性的结果。

体外h-CLAT方法如何用于区分致敏剂和非致敏剂？ 

h-CLAT法是一种体外定量THP-1细胞表面标记物CD86和CD54过表达的方法。在将带有测试项目的细胞暴露24小时后，对细胞进行处理。这些单核细胞THP-1激活的表面标记物模拟树突状细胞（DC）激活。在用荧光标记的抗体对细胞进行染色之后，通过流式细胞术对这些细胞表面标记物的表达进行定量。同时进行细胞毒性评估，以测量在细胞毒性浓度下是否发生表面标记物表达的上调。将表面标记的RFI值与对照进行比较，并将其用于预测模型中，以对致敏剂和非致敏剂进行分类。

LLNA分析的替代方法是什么？ 

体外试验代替了“局部淋巴结试验”，体外研究可广泛用于确定该化合物是致敏剂还是非致敏剂。仅在根据体外研究结果无法将化合物归类为致敏剂或非致敏剂的情况下才需要进行LLNA。体内试验通常在征得监管机构许可后可以进行。

什么时候需要体内试验?

仅在以下情况下才需要进行体内试验：

1. 可用的体外化学试验不适用于试验物质；或从此类方法获得的结果不足以进行分类和风险评估。 

2. 结论性试验：被测物质的溶解度低或logP> 7，则测试金属化合物，混合物/ UVCB的含量小于2000μM（角蛋白测定）。

在体外皮肤吸收研究中如何分析放射性和非放射性化合物？ 

对于该研究，测试项目可以是C₁₄放射性标记的或非放射性标记的。在研究过程中，基于皮肤渗透，通过液体闪烁分析仪测量与吸收的材料相关的放射性。通过精密的HPLC或LCMS / MS分析非放射性标记的化合物中活性成分的定量存在。

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