新型生物杀线虫剂Majestene
日期:01-23-2018
作者：杨田甜，申继忠
目前，全球不同地区和不同国家对生物农药的管理规定和登记要求差别很大。美国是全球生物农药登记要求最为灵活的，因此获得登记上市的品种和数量都居前列。欧盟要求相对苛刻，因此登记进程缓慢。有些产品如植物农药和微生物代谢产物农药，由于对其“有效成分”的认定存在一定的困难，常常延缓登记进程，甚至导致登记失败。研究发现，植物农药和微生物代谢产物农药往往难以认定某单一组分是所谓的“有效成分”，而是多个组分协同作用才产生可以接受的应用效果。但是，管理者常常要求登记申请者提供活性组分的一系列资料，这显然是难以做到的，所需要的成本也是中小型企业难以负担的。因此，综合考虑这类产品的安全性和在历史上长期安全使用等因素给予产品登记授权，加快此类生物农药上市是一个更为人性化的思路。像对待化学合成农药一样对待生物农药的“有效成分”并提出类似要求则是不适当的。甚至有些微生物杀虫剂的标签上把发酵产物整体计入有效物含量。如微生物杀虫剂Grandevo®标签显示发酵物含量为30%（作为有效物），北美市场上销售的苏云金杆菌杀虫剂标签上也有用发酵产物作为有效成分含量的（如Dipel®DF标签含量为54%）。本文介绍的产品有效物含量则标明为94.46%，这一由美国批准登记的新型微生物杀线虫剂Majestene的典型案例，值得我们思考。
Majestene是由美国MBI（Marrone Bio Innovations, Inc.）公司自主筛选发现的一种具有全新作用机理的杀线虫剂。已于2015年底获得美国环保署（EPA）的登记批准。目前MBI正在进行美国各州的登记，涉及的州包括亚利桑那、佛罗里达、乔治亚、爱达荷、北卡罗来纳、北达科他、新墨西哥、俄勒冈、宾夕法尼亚、南卡罗来纳、德克萨斯、华盛顿和威斯康辛等。然而，在科罗拉多州、缅因州、密歇根州、蒙大拿州、纽约州、南达科他州和波多黎各州的登记申请暂缓。此外，MBI还将在全美的其他州陆续进行登记。
作为生物制剂的Majestene与传统的化学杀线虫剂相比具有对有益昆虫低风险，且无残留的特点，此外它还兼具多重作用模式，能够防治传统的以及有机作物上的多种线虫。其液体制剂可施用于土壤，无使用次数的限制，无安全间隔期要求，使用后再进入时间仅为4小时。
1 有效成分与作用机理
据MBI介绍，Majestene的活性成分是失活的伯克霍尔德氏菌属的A396菌株（Burkholderia spp. strain A396）的死细胞以及发酵液，杀线虫的活性物质来自于发酵过程中产生的代谢物。
伯克霍尔德氏菌属的细菌广泛存在于土壤、根际、昆虫、真菌和水体中，属于变形菌门下的1个属，包括存在于各种不同生态位的60多个种。传统上，它们是为人们所熟知的植物病原体。洋葱伯克霍尔德氏菌（Burkholderiacepacia）作为该属的模式种，是第1个被发现的可以引起洋葱病变的病原体。一些伯克霍尔德氏菌属的细菌已经被开发出与宿主植物互利共生的有益一面，比如协助植物固定空气中的氮或促进植物根瘤的产生。另外，伯克霍尔德氏菌属的一些种被发现具有潜在的可作为生物防治产品的功能，能够防治土壤中本来存在的和植物茎叶以及收获后的秸秆中存在的病原体。有些已经有效地以生物修复的方式应用于修复受污染的土壤和地下水。除此之外，研究发现该属的另外一些种可以分泌出多种具有分解脂肪、蛋白质和具有溶血功能的胞外酶，以及毒素、抗生素和铁载体。这种代谢物的多样性，使得伯克霍尔德氏菌属成为非常理想的生物防治技术的材料来源。
研究表明，从土壤中分离出的伯克霍尔德氏菌属的菌株A396，表现出对节肢动物有很好的生物防治功效。用来测试生物效应的代表生物有咀嚼式（甜菜夜蛾(BAW)，Spodoptera exigua）和刺吸式（棉红蜘蛛(TSSM)，Tetranychus urticae）的节肢动物，在实验室的条件下测试A396全细胞培养液（whole-cellbroth (WCB)）之稀释液的杀虫活性范围。生物测定结果表明，A396作用方式有两种：内吸与触杀。用1%～4%（Ｖ/Ｖ）的全细胞稀释液处理4天后，叶片上的害虫防效达到 (75±22)%；处理3天时，因触杀导致幼虫死亡率达到50%。此外，还观察到虫体变色、发育迟缓和无法蜕皮等现象。经过处理的叶片上的棉红蜘蛛（TSSM）死亡率达到93%。所用的活性物质是热处理后（60℃，2小时）的无细胞的上清液，表明具有杀虫活性的物质可能是次生代谢物或细菌分泌出的耐热酶。
实验者没有试图从死亡的害虫中分离A396菌株，所以无法评估其对害虫的致病性。然而，试验采用的是无细胞的上清液可以清楚地表明不要求活细胞具有杀虫活性。事实上，除去细胞之后并且加热后的上清液与之前的活性保持相同的水平。
在实验中，对昆虫的取食与接触情况进行了评估，结果证明，可能活性物质对害虫和害螨的表皮发育与蜕皮有影响。用A396处理棉红蜘蛛（TSSM）呈现出明显的黑化作用（即体表变黑）以及外骨骼失去完整性（即昆虫在轻触情况下就解体）。对于甜菜夜蛾（BAW），生物效应的观察可以表明蜕皮与表皮的形成过程被阻断，甜菜夜蛾的幼虫发育不良（处理组的幼虫明显小于对照组）、蜕皮受阻（幼虫的表皮不脱落或只是部分脱落）、以及蛀屑液化。对两种昆虫的观察都可以与酶促降解体外骨骼结构和干扰昆虫蜕皮的过程相联系。几丁质酶可以水解几丁质，而此种物质是组成部分昆虫的外骨骼和围食膜的重要物质。昆虫表皮是由几丁质组成，为昆虫提供物理屏障，保护昆虫免于病原体或其他环境危害；中肠的围食膜是另一种由几丁质组成的，保护昆虫免受病原体侵害的屏障。任何可以穿透这层膜的酶类都具有生物杀虫剂的潜力，文献已有报道几种热稳定性的几丁质酶。具有杀虫活性的蛋白酶主要分为三类：半胱氨酸蛋白酶、金属蛋白酶和丝氨酸蛋白酶。这些蛋白酶类的目标是昆虫的中肠、角质层和血腔，可以增强媒介物如杆状病毒类的杀虫活性。中肠围食膜是1个用来控制虫害的理想靶标，它在保护昆虫中肠上皮细胞免受食物残渣、消化酶和病原体的侵害中扮演了生化屏障的角色。杆状病毒可以增强锌金属蛋白酶的表达，促进核型多角体病毒感染鳞翅目的昆虫。这些蛋白酶通过分解中肠细胞围食膜的粘蛋白，从而促进鳞翅目幼虫中肠上皮细胞的感染。与杆状病毒具有同样增强效用的同源基因已经在鼠疫杆菌、炭疽杆菌、苏云金杆菌和腊质芽孢杆菌中发现。伯克霍尔德氏菌属已被证明是已知的可以产生几丁质酶和蛋白酶的菌类，也是产生其他可能导致昆虫表皮和中肠分解的酶类和代谢产物的菌类。芽孢杆菌属是已知的能够产生耐热性的具有杀虫活性的毒素和蛋白酶的菌类。
Burkholderia spp. A396作用缓慢也指出了其非神经毒性的作用模式，神经毒性的典型症状如震颤和麻痹，在处理的昆虫中没有被观察到。目前为止，已经明确了Burkholderia spp. A396的部分代谢产物的结构和生物活性，见表1。但是完全阐明A396菌株的作用模式，以确定是否有任何多肽或蛋白质对杀虫活性有贡献，还需要进一步的研究。
表1 Burkholderia spp. A396的部分代谢产物
2 Majestene的产品组成和理化性质
商品化的Majestene产品是液体制剂，产品组成与理化性质分别见表2和表3。
表2 Majestene的产品组成
表3 Majestene的理化性质
3 Majestene的防治目标与使用剂量
Majestene主要用于以下作物，防治目标主要有：根结线虫属（Meloidogyne spp.)、短体线虫属（Pratylenchus spp.）、刺线虫属（Belonolaimus spp.）、矮化线虫属（Tylenchorhynchus spp.）、松材线虫属（Bursaphelenchus spp.）和肾型线虫属（Rotylenchulus spp.）等线虫类。
表4中列出的Majestene的防治目标与使用剂量来自于MBI公司在美国登记的产品标签。
表4 Majestene的适用作物与使用剂量
4 Majestene产品毒性和环境安全性
该产品属于纯生物制剂，对哺乳动物和环境生物均安全，在环境中无残留。根据Majestene产品的安全信息资料，其毒性数据如下：
急性经口毒性：LD50＞5,000 mg/kg(大鼠)。
急性经皮毒性：LD50＞5,050 mg/kg(大鼠)。
急性吸入毒性：LC50＞5.22 mg/L(大鼠)。
眼刺激：无刺激性（兔子）。
皮肤刺激：轻微刺激（兔子）。
皮肤敏感性：无致敏性（豚鼠）。
对环境生物的毒性数据如下：
鸟类急性经口毒性：北美鹑LD50＞2,000 mg/kg体重，无毒，分类为五级。
对水生生物的毒性：虹鳟鱼（96小时急性毒性）EC50＞1,000 mg/L，低毒，分类为四级；大型溞（48小时急性毒性）EC50＞48 mg/L，分类为三级。
对蜜蜂以及其他有益昆虫毒性：产品暴露于蜜蜂以及其他授粉昆虫的可能性极小，在蜜蜂觅食时并不施用本产品。
本品不允许漂移到蜜蜂觅食所在的开花作物或杂草上。
尽量减小喷雾漂移，减少对其他非靶标昆虫的影响。
Majestene对环境安全，使用后没有种植等待期。种植前后都可以使用，广谱土壤害虫和线虫防治剂。只需要4小时的使用后进入时间（REI）和零天的安全间隔期。豁免最大残留限量（MRL）要求，需要最少的个人防护和不需要缓冲带，被批准用于大田和温室使用。本品符合美国国家有机项目（NOP）要求，并获得美国有机材料评审研究所（OMRI）认证。
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