使用N-亚硝基-N-乙基脲和苯并(a)芘进行体内Pig-a基因突变试验

作者：Jay Ranade、Karishma Desai、Manish Patel和Rajendra Nagane

 <Jai Research Foundation (JRF)>

引言：

啮齿动物Pig-A试验以其独特的优势日益得到科学界的认可。值得注意的是，它所需血量极少，因为即使一微升血液中也含有数百万个红细胞和一小部分网织红细胞。这种试验方法特别适用于重复采血，无需对动物实施安乐死，因此符合动物试验中的3R原则（替代、减少和优化），是一种符合伦理的选择。它与常规的啮齿类动物模型的兼容性及其在监管安全评估中的应用，使其在体内突变研究中越来越受欢迎。Pig-a试验可有效研究体细胞基因突变，是监管安全评估中细菌突变实验的补充。正如经合组织试验指南所述，它能很好地融入各种毒理学研究，使其成为评估致突变性和探索其他体外系统中已被识别的潜在基因毒性的重要工具。我们的研究重点是评估连续给药三天后暴露于N-亚硝基-N-乙基脲（N-Nitroso-N-Ethylurea）和苯并(a)芘（Benzo(a)Pyrene）的Wistar大鼠的Pig-a基因突变情况。

原理：

本试验围绕Pig-A基因开展，该基因对N-乙酰氨基葡萄糖磷脂酰肌醇（GlcNAc-PI）的产生至关重要。N-乙酰氨基葡萄糖磷脂酰肌醇是参与GPI锚生物合成的基础化合物，而GPI锚对于将蛋白质固定到血细胞表面至关重要。虽然GPI锚合成涉及约30个基因，但位于X染色体上的Pig-A基因是唯一的单拷贝基因，Pig-A基因突变主要导致GPI锚和相关蛋白的缺失。该试验方法利用荧光抗体对网织红细胞和红细胞上的蛋白质进行检测，并利用流式细胞仪测量突变细胞频率。

材料与方法：

我们的Pig-a试验所使用的材料是Sigma-Aldrich公司的N-亚硝基-N-乙基脲和苯并(a)芘，以及Litron Laboratories公司的Muta Flow® PLUS 25-R试剂盒（其中包括特异性抗体和试剂）。其他设备如Octo-MACS™分离器和MS型细胞分选柱均来自Miltenyi-Biotech公司。实验中使用的雄性和雌性Wistar大鼠均来自JRF的动物养殖中心，并按OECD TG 470指南和Muta-Flow PLUS 试剂盒说明书进行操作。

结果与结论：

研究发现，与对照组相比，雄性大鼠和雌性大鼠在按每公斤体重接受20毫克N-亚硝基-N-乙基脲（ENU）和125毫克苯并(a)芘给药三天后，每106个红细胞（RBC）总数中的RBCCD59-和每106个网织红细胞（RET）总数中的RETCD59-均显著增加。这一发现凸显了该试验方法在检测致突变性方面的有效性及其在更广泛的监管安全评估中的潜力。

本实验结果非常乐观，充分显示了啮齿动物体内Pig-a试验在我们的实验室条件下的稳健性。因此，该试验可作为体外基因毒性评估的独立或后续试验，也可作为常规亚急性或亚慢性毒理学研究的复合试验。

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