中国科学院：利用跨界RNAi提高生防真菌杀虫效力，为生物杀虫剂开辟了新方向和新思路

世界农化网中文网报道：2022年10月25日，中国科学院分子植物科学卓越创新中心王四宝研究员团队在Cell Reports杂志在线发表题为″Expression of mosquito miRNAs in entomopathogenic fungus induces pathogen-mediated host RNA interference and increases fungal efficacy″的研究论文。

该研究研发出一种利用宿主昆虫体内具有免疫抑制功能的miRNAs，遗传改造杀虫真菌增强其生防效力的″以子之矛，攻子之盾″新方法，为生防菌的遗传改良开辟了新方向。

昆虫通过取食作物或吸血给农业生产和人类健康造成严重危害。蚊虫是疟疾、登革热、黄热病、寨卡等多种疾病的传播媒介，对人类的健康和生命安全造成了严重威胁。目前，蚊虫的防治主要依赖化学杀虫剂，但是化学农药的长期使用导致蚊虫对杀虫剂产生抗药性，迫切需要研发新的绿色替代工具来安全有效地防治蚊虫。球孢白僵菌作为一种天然的昆虫病原真菌，能够通过体表侵染并杀死昆虫，对防治刺吸式口器的蚊虫具有独特的优势，是一种环境友好型的微生物杀虫剂。

然而，由于病原真菌一般杀虫时间长（一般需要一周甚至更长的时间），制约了真菌杀虫剂的广泛应用。这主要是由于昆虫在与病原菌长期攻防和博弈的过程中进化出高效的免疫防御系统对抗真菌的侵染所致。为此，许多研究通过高表达外源毒素或毒力蛋白等对菌株进行遗传改良来增强生防真菌杀虫效力。但是效应蛋白作用靶标单一，还会导致靶标昆虫产生选择性压力，因此亟待开发多靶点、无选择压力、更加安全的效应因子对杀虫真菌进行遗传改良。

图：蚊子吸蜜

Small RNA（sRNA, 主要包括miRNA和siRNA）介导的RNA干扰（RNA interference, RNAi）是真核生物中高度保守的基因转录后表达干扰机制。miRNA在昆虫响应病原菌侵染的免疫调控中发挥重要作用。王四宝团队前期研究发现，sRNA可在蚊虫与病原真菌间进行双向传递，参与调控蚊虫免疫和病原真菌的致病性，这种突破物种界限，跨物种转运到寄主或微生体细胞内干扰靶基因表达的现象，称为跨界RNA干扰（Cross-kingdom RNAi）。这种sRNA的双向跨界传递表现在：蚊虫可以将自身保守的miRNA传递到病原真菌细胞来跨界抑制致病基因的表达，抑制真菌感染^【1】；同样，病原真菌也可以将自身上调表达的sRNA跨界转运到感染蚊虫细胞内干扰免疫基因的表达^【2】。这些前期研究提示我们或许可以利用sRNA在昆虫与病原菌互作过程中跨界调控的功能，使其成为高效的效应因子应用于生防真菌的遗传改造。

本研究中，研究人员从埃及伊蚊体内筛选鉴定出两个负调控其自身Toll免疫信号通路的miRNAs （miR-8和miR-375），通过基因工程改造，在白僵菌中成功构建表达伊蚊miR-8或miR-375的工程菌株。与野生型白僵菌相比，表达伊蚊miRNAs的转基因菌株在感染蚊虫过程中能够产生大量miR-8或miR-375，这些miRNAs能够从真菌细胞跨界转运到感染的蚊虫细胞内，分别靶向沉默伊蚊Toll免疫信号通路受体Toll5B和转录因子Rel1A的转录表达，同时还激活Toll通路抑制因子Cactus的转录表达，从而下调蚊虫抗菌肽基因表达，降低蚊虫抗真菌的免疫反应，进而增强白僵菌对蚊虫的致病力和加快蚊虫死亡速度。

野外调查研究发现，多地蚊虫对氯菊酯、氯氰菊酯等各类化学杀虫剂产生了不同程度的抗药性，严重影响蚊虫防治效果。为验证蚊虫免疫抑制性miRNAs改造的白僵菌是否对抗性蚊虫有防治效果，研究人员对具有多种杀虫剂抗药性的埃及伊蚊Jinghong品系进行测试，发现表达miR-8或miR-375的工程菌株比野生型菌株表现更强的杀虫效果，缩短半数致死时间（LT50）达30%左右。

研究人员进一步分析发现miR-8和miR-375在埃及伊蚊、冈比亚按蚊、小菜蛾等多种害虫中序列保守，靶基因预测分析发现miR-8和miR-375都能靶向这些昆虫的Toll免疫信号通路相关基因。为验证表达 miR-8或miR-375的工程菌株是否对其它害虫也有防治效果，研究人员对鳞翅目害虫大蜡螟进行测试，发现表达miR-8和miR-375的菌株对大蜡螟呈现较强的致病力，显著加速白僵菌对大蜡螟的击倒时间，能够缩短半数致死时间（LT50）达20%-40%左右，共表达miR-8和miR-375对菌株毒力有显著增效作用。

图：利用病原菌介导的RNAi (pathogen-mediated RNAi，pmRNAi)提高生防真菌杀虫效力

该研究中王四宝研究员团队利用″以子之矛，攻子之盾″的策略，首次开发出一种利用生防菌表达寄主miRNAs跨界干扰害虫基因的表达来提高生防菌杀虫效力的新方法（pathogen-mediated RNAi，pmRNAi）。pmRNAi方法具有以下多重优点：

1）使用寄主来源的miRNA进行菌株改良可避免害虫产生抗性选择压力，因为昆虫对自身免疫和生理健康至关重要的内源性miRNA不易产生选择抗性；

2）相对于外源毒素或毒蛋白基因，使用害虫自身的miRNA可以消除公众对工程菌株生物安全性的担忧；

3）某些昆虫来源的miRNAs具有种属特异性，因此可通过定制害虫特异的miRNA来改良菌株，提高工程菌的寄主靶向性和特异性；

4）相对于靶标单一的杀虫毒蛋白，miRNA具有多靶标特性，单个miRNA可在一个或多个途径中靶向多个基因以发挥其生物学功能，而且一个靶基因的表达也可受到多个miRNAs的组合调控；

5）在理论上一个菌株中可表达多个寄主miRNAs，从而实现对害虫免疫或其他生理过程的重要靶基因或通路的操控，有效提高真菌杀虫剂的防治效果，使得该方法在生防菌的遗传改良上具有巨大的应用潜力。

该研究利用丰富的寄主miRNAs改造生防菌，为开发安全和高效的真菌等生物杀虫剂开辟了新方向和新思路，为昆虫与病原体相互作用研究提供新的思路。

论文链接：

https://doi.org/10.1016/j.celrep.2022.111527

参考文献

【1】Cui C, Wang Y, Liu J, Zhao J, Sun P, Wang S. A fungal pathogen deploys a small silencing RNA that attenuates mosquito immunity and facilitates infection. Nat Commun. 2019,20;10(1):4298. doi: 10.1038/s41467-019-12323-1.

【2】Wang Y, Cui C, Wang G, Li Y, Wang S. Insects defend against fungal infection by employing microRNAs to silence virulence-related genes. Proc Natl Acad Sci USA. 2021,11;118(19):e2023802118. doi: 10.1073/pnas.2023802118.