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急性经口毒性实验方法的比较与选择 qrcode

2018-10-19

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 世界农化网中文网报道: 国内外的农药管理机构在对农药进行安全评价时,农药的急性毒性实验是必不可少的。通过研究实验哺乳动物在不同接触途径(口腔、皮肤、呼吸道、眼睛)下对农药的中毒反应,来推测该农药对人类、家畜等的毒性大小,从而为安全生产、储存、运输及使用农药制定指导性文件。
 
 
1、急性经口毒性的概念
急性经口毒性(acute oral toxicity):
机体一次或24h内多次经口接触外源化学物后在短期内(最长14天)所产生的毒性效应,包括一般行为和外观改变、大体形态变化以及死亡效应。
 
2、急性经口毒性试验的目的
1)求出致死剂量及其他急性毒性参数
2)观察中毒表现、毒作用强度和死亡情况,初步评价毒物的毒效应特征
3)为其他毒理试验提供接触剂量和选择观察指标的依据
4)为毒理学机制研究提供线索
 
3、急性经口毒性的参数
半数致死剂量:LD50
 
4、实验要点
 
(一)健康实验动物的选择和性别鉴定。
(二)实验动物称重、编号和随机分组方法。
(三)受试化合物溶液的配制。
(四)小鼠灌胃技术。
(五)毒性症状的观察和LD50计算。
 
5、国际通用的几种急性经口毒性实验方法
传统的急性经口毒性试验多采用霍恩氏法和改良寇氏法。我国过去普遍采用的急性毒性的评价方法大体上可以归为两类:一是死亡率剂量反应要求为正态分布的,其中概率分配图解法和寇氏法(Karber)较为常用;另一类是不要求为正态分布的(非正态分布),查对有关表格即可得到LD50值,如霍恩氏法(Horns)等。
 
目前中国主要采用三种急性经口毒性试验方法,分别为霍恩氏法、序贯法(up-and-down procedure)、概率单位法(Miller and Taninter’s method)。具体方法可参看中华人民共和国国家标准GB/T 15670-2017 (农药登记毒理学试验方法)第2、3、4部分内容。
 
美国EPA农药登记推荐的方法是OPPTS 870.1100,实际内容与OECD 425 (up-and-down procedure)一致。
 
经济合作与发展组织(OECD)发布的几种急性经口毒性实验方法指南:
OECD TG420 - 固定剂量法(Fixed dose procedure(FDP))、OECD TG423 - 分级试验法(Acute toxic class method (ATC))和 OECD TG425 –序贯法或上下移位法(Up-and-down procedure (UDP))是目前国际上通用的3种主要的LD50测试替代方法(2002年开始取代了最早的OECD 401-Draize法)。
 
三种OECD方法的相同点与不同点比较
 
相同点:
1)都非常强调对动物染毒后的仔细观察和记录,皮、毛、眼睛、黏膜的改变,呼吸、循环、植物神经系统和中枢神经系统、运动和行为等临床体征的观察可以提供许多有价值的信息。
2)试验结果都在不同程度上受起始剂量的影响,在实验设计阶段要求尽可能获取受试化学物的相关资料,包括毒性与结构关系的分析等,从最合适的剂量开始试验,将有利于取得最好的结果。
3)还有1个共同点是引入了“人道主义处死”的概念和要求,承受剧烈疼痛和痛苦的垂死动物应人道主义地处死,这类处死的动物在结果处理时以实验中死亡计。
4)都使用单一性别动物(推荐采用雌性动物,因为一般情况下雌性更敏感) 。
 
不同点:见下表
 

 

OECD TG420-固定剂量法

 

(HDP)

 

OECD TG423-分级试验法

 

(ATC)

 

OECD TG425-上下移位法

 

(UDP)

方法的发展

 

1984年英国毒理协会提出,OECD 2001年作为指南TG420

1990年Sumiey提出,OECD于1996年采用,于2001年更新列为指南TG423。目前欧洲使用此方法比较普遍。

1948年Dixon和Mood首次提出,OECD于1998年采用,2006年更新列为指南TG425

原理简介

固定5,50,300,2000mg/kg四个剂量组,(必要时可以增加5000mg/kg),依次使用同一性别的动物(一般为雌性),经口染毒。根据预试验结果,确定会发生毒性反应,但不产生严重的毒性反应或死亡的剂量作为起始剂量进行试验,再根据观察的结果调整毒性剂量,当出现以下情况时终止试验:1,当出现明显的毒性反应或已确认不多于1只动物死亡;2,最高剂量未出现毒性反应;3,最低剂量动物出现死亡。

试验分为若干阶段,每阶段使用3只动物,最多6只动物。已设计四个固定的剂量5,50,300,2000mg/kg,选定一个初始剂量进行试验,根据试验结果(动物死亡或者濒临死亡的动物数量)来判定是否进行下一步试验或者终止试验。有三种可能的结果:1,无需进一步试验即可分级;2,同一剂量水平再做3只动物;3,在高一级或低一级剂量水平另做三只动物。

由限度试验和主试验组成,限度试验分为2000mg/kg和5000mg/kg两个剂量水平,用于受试物毒性较小的情况,两种剂量限度试验过程有细微差别,但最多只用5只动物。主试验是一个预先设定的染毒程序,每次染毒1只动物,有1只动物染毒后的反应决定第2只动物接受染毒的剂量,若动物存活,第2只动物给予高一级剂量,若第1只动物死亡或出现濒临死亡的状态,则第2只动物给予低一级别剂量。在对每只染毒动物观察48小时候,可以决定是否对下一只动物染毒以及确定染毒剂量。当满足停止试验的标准时,可以结束试验。

每次使用动物数量

5-7只

平均7只

6-9只

每次试验动物死亡数量

1只

2-3只

2-3只

 

每剂量水平使用动物数

5只

3只

1只

 

全部试验最多所需动物数

20只

12只

15只

实验动物数

只需10~20只动物(预试一般不超过5只动物;主实验:每个剂量最少用10只动物,雌雄各半)

6-12只动物 (2000mg/kg 限量试验:6只动物; 5000mg/kg: 3只动物; 主实验:最多12只)  

限量试验: 最多5只;  主实验: 通常4-6只,最多15只

剂量选择

限量实验: 2000 or 5000mg/kg bw; 主实验: 5,50, 300, 2000mg/kg bw

限量实验: 2000 or 5000mg/kg bw;主实验: 5,50, 300, 2000mg/kg bw

限量实验: 2000 or 5000mg/kg bw;  1.75 、5.5 、17.5 、55 、175 、550 、2000 mg/kg (或有特殊要求时1.75 、5.5 、17.5 、55 、175 、550 、1750 、5000 mg/kg

观察的指标

不以动物死亡作为研究的终点,而是以毒性发展的临床体征的观察作为终点,对化学品急性毒性进行分类。

用于危害评估危害分类,以及危害度评价,它是以动物死亡作为试验终点的分阶段试验法。

以动物的死亡作为研究的重点,同时进行毒性表现的观察。

 

LD50的值和置信度

不能精确估计LD50的值和LD50的置信限,但是可以粗略的估计LD50的范围。同样对于死亡剂量反应曲线的斜率和置信限也无法估计。

不能精确估计LD50的值和LD50的置信限,但是可以根据提供的数据使用最大相似法进行计算。该方法也适用于死亡剂量反应曲线的斜率和置信限的估计。

不但可以进行毒性表现的观察,还可以估算LD50及其可信度,适用于能引起动物快速死亡的受试物。不适用于有迟发型毒性反应特点的物质。

应用情况

采用这种方法的实验室较少

普遍使用,大部分国家接受

美国、中国推荐使用

特点

固定剂量、观察动物反应,不以死亡为依据,而且按毒性症状来判断该物质的危险程度

每阶段3只动物,2-4阶段即可判定急性毒性。死亡动物数一般不超过3只。

节省实验动物,同时,不但可以进行毒性表现的观察,还可以估算LD50 及其可信限。死亡动物数一般不超过3只。

 

6、选择实验方法时需考虑的因素
A. 明确提交登记的目标国家:比如中国和其它国家通用的报告,可选择既有中国农业部认可试验单位资质又有OECD GLP证书的实验室,选用OECD TG425方法。如果仅用于国外登记,选择OECD TG423就没问题,通用性很广。
B. 根据参考产品的LD50数值,考虑不同目标国家的毒性分级标准:如果按GHS毒性分级标准,选用OECD TG423比较匹配,参考产品LD50值大于5000mg/kg的产品,选用以上任何方法都可以。
C. 根据受试物的特性:OECD TG425不适用于有迟发型毒性反应特点的物质。
 
来源: 颖泰分析

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